铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是兰科(Orchidaceae)多年附生草本植物,富含石斛多糖、生物碱、氨基酸、微量元素等多种药用成分,在我国的云南、浙江、福建、广东和广西等省份均有分布。随着铁皮石斛及其衍生产品的开发利用,野生资源遭到过度采挖,日益枯竭,由野生种质驯化而来的栽培种质也逐渐趋于单一,因此需要在铁皮石斛野生资源的鉴定保护和新品种的人工选育方面积极开展工作。本研究采用多倍体育种方法对铁皮石斛进行诱导鉴定;对比不同倍性铁皮石斛多糖含量,分析多糖合成相关酶基因表达量;根据铁皮石斛转录组Unigenes开发EST-SSR分子标记,用于铁皮石斛种质资源的分子鉴定。本研究选择秋水仙素为诱导剂,铁皮石斛原球茎和丛生芽为外植体,探究秋水仙素浓度和处理时间对铁皮石斛原球茎和丛生芽存活率和变异率的影响。在较高浓度秋水仙素中,原球茎和丛生芽的存活率随处理时间增加明显降低,变异率没有表现出与处理时间的相关性,并且原球茎的存活率低于从生芽;原球茎在秋水仙素浓度为0.6 mg/L处理30 min的组合中产生的变异植株最多,丛生芽的变异植株集中在0.8 mg/L秋水仙素处理30 min的组合中;原球茎对秋水仙素更敏感,而丛生芽对秋水仙素更耐受。为了准确地将多倍体铁皮石斛从处理材料中鉴定出来,本研究分别从外部形态特征、气孔保卫细胞特征、染色体数目、细胞核DNA含量等方面进行鉴定。本研究采用热水浸提法提取石斛多糖,苯酚-硫酸法计算多糖含量,对比铁皮石斛二倍体和四倍体的多糖含量。结果表明,四倍体植株的多糖含量显著高于二倍体植株,增加了 30.34%,多倍体铁皮石斛的多糖含量得到了提升。选择三种铁皮石斛多糖合成相关酶基因:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGP)和蔗糖磷酸合成酶基因(SPS),研究它们在四倍体和二倍体铁皮石斛植株中的表达量,从转录水平探究染色体加倍对多糖合成量的影响。结果表明,四倍体铁皮石斛PEPC基因、SPS基因和UGP基因分别是二倍体的4.006倍、2.996倍和2.876倍,三种基因在四倍体铁皮石斛中的表达量都表现出上调。EST-SSR是一种高效便捷的分子标记方法,本研究基于铁皮石斛转录组Unigenes,利用生物信息学筛选出983个EST-SSR,发现铁皮石斛的EST中存在着不同重复类型,有二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸和六核苷酸四种类型,其中三核苷酸的数目最多,达到84.94%。在此基础上设计240对引物对18份铁皮石斛样品材料进行多态性扩增,成功开发出16条EST-SSR分子标记,为铁皮石斛保护遗传学、亲缘地理学及其遗传育种奠定基础。