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目的:应用靶向DNA甲基转移酶1(DNMT1)基因的短发夹RNA(shRNA)重组质粒来转染体外培养的食管鳞癌细胞,并建立裸鼠的动物移植瘤模型,研究其对食管鳞癌细胞增殖、转移和侵袭的影响。方法:1.实验组予以shRNA-DNMT1序列进行转染,对照组仅予以shRNA-NC阴性对照序列,构建沉默DNMT1基因的重组慢病毒并感染食管鳞癌细胞后获得稳定细胞株,建立裸鼠的动物移植瘤模型。2.cell counting kit 8(CCK-8)检测细胞增殖生长能力。3.集落形成实验检测细胞形成集落的能力。4.Transwell实验检测肿瘤细胞的侵袭和转移能力。5.流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡与周期。6.实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测食管鳞癌细胞和裸鼠移植瘤组织中抑癌基因P16、CDH13、RASSF1A、APC、MGMT、ASC、DAPK和DNMT1的mRNA表达。7.甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR,MSP)检测食管鳞癌细胞和裸鼠移植瘤组织中抑癌基因RASSF1A和DAPK的甲基化状态。8.Western blot检测食管鳞癌细胞和裸鼠移植瘤组织中抑癌基因RASSF1A和DAPK所调控的蛋白和DNMT1蛋白的表达。9.免疫组化检测裸鼠移植瘤组织中RASSF1A和DAPK蛋白的表达。结果:1.成功构建沉默DNMT1基因的重组慢病毒并感染食管鳞癌细胞,获得稳定细胞株。2.与对照组比较,qRT-PCR结果表明食管鳞癌细胞和裸鼠移植瘤中实验组DNMT1的mRNA表达明显减少,而RASSF1A和DAPK的mRNA表达明显增多(P<0.01)。3.Western blot表明食管鳞癌细胞和裸鼠移植瘤中实验组DNMT1蛋白水平明显降低,而RASSF1A和DAPK所表达的蛋白水平明显增多(P<0.05)。4.CCK检测表明实验组中细胞增殖速度明显减慢(P<0.05)。5.集落形成实验表明实验组中细胞的集落数明显减少(P<0.01)。6.Transwell实验表明实验组中食管鳞癌细胞的侵袭和转移能力明显减弱(P<0.01)。7.流式细胞仪检测结果显示:与对照组相比实验组食管癌细胞的凋亡细胞百分比增高(P<0.01),集中在早调阶段;与对照组相比,实验组食管癌细胞呈现以下改变:DNA合成前期(G0/G1期)细胞的百分比增高(P<0.001),DNA合成期(S期)细胞的百分比减少(P<0.001),DNA合成后期(G2/M期)细胞的百分比减少(P<0.001)。8.免疫组化表明裸鼠移植瘤中实验组RASSF1A和DAPK蛋白表达明显增多(P<0.05)。9.甲基化特异性PCR(MSP)表明食管鳞癌细胞和裸鼠移植瘤中实验组RASSF1A和DAPK的甲基化受到抑制。结论:沉默DNMT1可以通过调节RASSF1A和DAPK基因甲基化的途径从而抑制食管鳞癌细胞的增殖,转移和侵袭。