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目的:NK细胞因其独特的抗肿瘤作用成为癌症治疗的方法,但实体肿瘤微环境中NK细胞不足是制约其临床疗效的重要因素,本研究通过基因修饰,研究过表达NK细胞趋化因子受体CCR7和CXCR4对NK细胞在体内、外对人结肠癌细胞的趋化性的作用及其抗结肠癌效应。方法:1.ELISA法检测健康人及结肠癌患者血清中趋化因子CCL21(CCR7配体),CXCL12(CXCR4配体)的表达。2.构建上调趋化因子受体CXCR4、CCR7慢病毒载体,Lipo2000转染至NK细胞中,筛选稳定过表达CXCR4、CCR7的NK细胞株。3.应用RT-PCR,Western blot检测稳定细胞株CXCR4、CCR7的表达效应。4.MTT实验检测NK细胞杀伤活性,tanswell实验研究NK细胞在体外对结肠癌细胞的趋化作用。5.构建皮下荷结肠癌SCID鼠模型,通过注射上调CXCR4和CCR7的NK细胞,用小动物活体成像仪分析这种NK细胞在荷瘤小鼠瘤体内的分布,观察各组荷瘤鼠瘤体积及生存周期,研究NK细胞抗结肠肿瘤作用。结果:1.本研究通过ELISA检测证明CXCL12、CCL21的表达水平:结肠癌患者血清水平高于健康人血清中水平,差异有统计学意义(P<0.001)。2.本研究通过慢病毒转染技术成功构建出稳定过表达双趋化因子受体CXCR4和CCR7的稳定NK细胞系,与野生型NK细胞相比,其CXCR4和CCR7 m RNA水平上调和蛋白表达量明显上调,差异有统计学意义(P<0.05)。并通过MTT实验分析表明,与野生型NK细胞杀伤活性相比,过表达双趋化因子受体的NK92细胞杀伤活性无明显变化,说明慢病毒转染并不损伤NK92细胞杀伤活性。3.通过transwell实验及小动物体内成像技术证明过表达双趋化因子受体CXCR4和CCR7的NK细胞在体内、体外对人结肠癌细胞表现出更强的趋化性。差异有统计学意义(P<0.05)。4.相比用PBS治疗的SCID荷瘤鼠的平均生存期(25d)和LW238 NK92细胞组SCID荷瘤鼠的平均生存期(33.5d),LW750 NK92组处理的荷瘤鼠平均生存期(45d)明显延长(P<0.05);而PBS组与LW238 NK92组小鼠生存周期差异无统计学意义。结论:1.慢病毒转染基因修饰技术能使NK细胞表面趋化因子受体CXCR4及CCR7在基因及蛋白分子水平,恒定上调表达;慢病毒转染基因修饰本身并不影响NK细胞的杀伤活性。2.细胞表面受体CCR7和CXCR4的表达上调可明显促进NK细胞自身向人结肠癌细胞或结肠癌组织(趋化因子源)的趋化及聚集过程,增加了瘤体局部NK细胞数量。3.趋化因子受体CCR7和CXCR4表达量上调的NK细胞,通过增加瘤体微环境的NK细胞数量和活性,而增强对人结肠癌瘤体生长的抑制作用,显著延长荷瘤鼠的生存期。4.NK细胞的趋化因子受体基因的修饰有望成为改善过继性肿瘤免疫疗法的重要方法。