单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种革兰氏阳性胞内寄生菌,在免疫力低下的人和动物中能够引起食源性疾病和高死亡率。单增李斯特菌致病的关键是其在进入宿主细胞时能在非吞噬细胞上发生内化作用,从而在其中存活和增殖。发生内化作用主要依靠内化素家族蛋白(internalin),单增李斯特菌内化素家族蛋白是一组富含亮氨酸重复区域(LRR),N端含有信号肽的蛋白质。经过分析预测,单增李斯特菌的内化素家族蛋白一共有25种,但是包括Lmo0549等在内的大部分内化素的功能尚未解释清楚。因此,本研究以Lmo0549为主的包括Lmo1136、Lmo1289和Lmo2027在内的内化素家族蛋白为研究对象,利用感染生物学,分子生物学等手段探索Lmo0549、Lmo1136、Lmo1289和Lmo2027在体外生存中的生物学功能,以及Lmo0549在感染过程中发挥的功能。1.单增李斯特菌内化素家族蛋白体外生长功能研究首先成功构建单增李斯特菌内化素家族蛋白Lmo0549、Lmo1136、Lmo1289和Lmo2027的缺失株,通过生长曲线的测定确定了缺失株不影响单增李斯特菌在的生长能力;然后通过在TSA半固体平板上的运动性试验,发现lmo0549缺失株对细菌的运动圈的显著减小,lmo1136、lmo1289和lmo2027缺失后运动圈无明显变化;且在电镜下观察发现lmo0549缺失株不能合成鞭毛,进一步从蛋白表达水平发现鞭毛合成关键蛋白Fla A蛋白表达量显著下调,增强了Gma R鞭毛蛋白的表达。这个分析结果证明了Lmo0549对鞭毛相关蛋白合成的重要性。2.Lmo0549在单增李斯特菌感染能力中的作用研究体外细胞试验表明,单增李斯特菌缺失lmo0549基因后,与野生株相比,在上皮细胞中的侵袭能力没有显著变化,在巨噬细胞中的存活和增殖能力无显著差异,但是lmo0549缺失后,细菌在成纤维细胞L929中的迁移能力显著减弱。进一步动物试验表明,与野生株相比,lmo0549缺失后,细菌在体内生存能力无显著差异,但小鼠的致病力减弱。本试验研究表明lmo0549缺失株细胞间的迁移能力以及致病力减弱。3.Lmo0549对单增李斯特菌基因表达量的影响研究我们将单增李斯特菌lmo0549缺失株进行了转录组测序分析,结果表明李斯特菌lmo0549缺失后,应激调控因子sig B、内化素B(inl B)和磷脂磷酸酶B(plc B)以及磷酸转移酶系统(PTS)等基因的转录水平差异显著。为了验证蛋白表达水平变化,我们收集全菌蛋白进行Western Blot检测,结果显示单增李斯特菌缺失lmo0549后,Sig B的蛋白表达水平上调,这与转录组测序结果结果一致,并使单增李斯特菌抗盐和酸应激的能力增强。综上所述,本试验主要以对单增李斯特菌内化素家族蛋白Lmo0549为主的包括Lmo1136、Lmo1289和Lmo2027在内的蛋白为研究对象,初步证明这些蛋白在细菌体外生长和体内外感染过程中不发挥关键的作用,但是lmo0549基因对李斯特菌的运动性和抗应激能力起到比较重要的作用。本试验研究结果为进一步探索单增李斯特菌适应环境和感染机制的调控机制做了基础研究,对后续研究单增李斯特菌的防控有重要参考意义。