Cupriavidus metallidurans YL2对Au(Ⅲ)的抗性研究

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高活性的金离子Au(III)已被证明会损害人体肝脏、肾脏和神经系统。工业生产中金矿的开采,会持续对环境负荷产生潜在负面影响。微生物在金(Au)的生物地球化学循环过程中起着至关重要的作用,因而了解微生物与土壤环境中Au的相互作用非常关键。细菌进化出了不同的生化机制来抵抗可溶性Au(III)的毒性,并参与Au(III)的转化。虽然在金颗粒上发现了耐金细菌,但其具体的耐金Au(III)机制尚不明确。因此,本研究选取从福建紫金山金铜矿区土壤中分离出的耐受金及多种重金属的细菌Cupriavidus metallidurans YL2为研究对象,旨在确定具有细菌Au(III)耐受性的潜在外排系统和关键功能基因。我们首先进行了初步形态、生理生化和分子生物识别表征。发现Cupriavidus metallidurans YL2具有很高的Au(III)耐受性。其次,进行了全基因组和Illumina–seq转录组测序,筛选了暴露于不同Au(III)浓度的差异表达基因,并分析了编码耐Au(III)功能的基因。最后,铜敏感菌株E.coli DW3110(342)中的异源表达进一步证实了上述潜在抗性基因的功能。通过上述情况,主要结果如下:(1)筛选与鉴定耐金菌株。通过富集实验,从福建省紫金山金铜矿区土壤中共分离出11株不同种属的重金属抗性细菌。用不同浓度的金溶液进一步筛选,以120μM最小抑制浓度(MIC)得到了一株对Au(III)具有高耐受性的细菌菌株,确定为贪铜菌属(Cupriavidus metallidurans YL2)。Gen Bank登录号为GCA 018672515.1。菌株YL2为革兰氏阴性菌,好氧、具有运动性;对p H和温度具有较高的适应性,能够利用多种碳源、氮源物质供能;对于常见10种重金属和7种抗生素具有良好的耐受性。(2)Cupriavidus metallidurans YL2的全基因组测序分析。菌株YL2的基因组大小为6,274,362 bp,分布在2个染色体上,基因组的GC含量为63.91%。通过注释发现存在多个重金属抗性基因簇,包括具有金抗性的cop EABCD、cus DCFBA和cup RAC基因簇,这些基因簇的存在能够增强菌株对Au的抗性,同时发现一个类似于czc ABC(hmy ABC)的金属外排系统。(3)Cupriavidus metallidurans YL2的转录组测序分析。结果表明,共有5897个基因被注释,通过DESeq分析获得2163个差异表达基因,其中上调基因为1055个,下调基因为1002个。在1μM和10μM Au(III)胁迫下,菌株YL2中基因簇hmy ABC的表达量均显著上调,而在Cu(II)胁迫下表达量下调。因此,推测菌株YL2的耐金性可能由hmy ABC编码的外排系统介导,hmy ABC基因簇赋予了菌株YL2特定的Au(III)外排功能,将细胞内的Au离子排出体外,以缓解Au离子的毒性。同时,RT–q PCR进一步验证了12个显著差异表达的基因,结果与转录组分析结果一致,证实了转录组测序结果的可靠性。(4)体外表达验证赋予金抗性的潜在基因功能。根据对菌株YL2全基因组和转录组数据的分析,筛选出两个潜在的金抗性基因reg A和kat E,并在大肠杆菌DW3110(342)中实现了异源表达。其中菌株YL2中的转录调节因子reg A基因赋予了大肠杆菌对Au(III)的耐受性,耐Au(III)能力达到30μM。kat E的耐Au(III)效果与对照组无差别,仅为10μM。综上所述,本论文发现在Cupriavidus metallidurans YL2中存在一种潜在的Au特异性外排系统hmy ABC,猜测其通过将金离子Au(I)/Au(III)从细胞质、周质转运到细胞外空间,抵御Au(I)/Au(III)的毒性。编码该RND外排系统的基因仅由金诱导,而不由铜诱导。与此同时,以大肠杆菌DW3110(342)为宿主细胞,异源表达了两个基因,发现基因reg A能够通过未知的机制赋予大肠杆菌Au抗性。
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