【摘 要】
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单克隆抗体是临床上治疗癌症的有效药物之一。传统的抗体治疗只能定位于细胞表面或作用于胞外抗原,但由于肿瘤相关的细胞表面或可溶性抗原相对较少,因此它们的靶区是有限的。而细胞内存在的大量蛋白,可成为潜在的治疗靶点。细胞内抗体是指能够在细胞内稳定表达并且靶向同一细胞内抗原的免疫球蛋白,具有特异性高,亲和力强的特性。胞内抗体技术是对基因敲除、反义核苷酸技术、RNAi、mi RNA等基因抑制技术的补充,可以调
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单克隆抗体是临床上治疗癌症的有效药物之一。传统的抗体治疗只能定位于细胞表面或作用于胞外抗原,但由于肿瘤相关的细胞表面或可溶性抗原相对较少,因此它们的靶区是有限的。而细胞内存在的大量蛋白,可成为潜在的治疗靶点。细胞内抗体是指能够在细胞内稳定表达并且靶向同一细胞内抗原的免疫球蛋白,具有特异性高,亲和力强的特性。胞内抗体技术是对基因敲除、反义核苷酸技术、RNAi、mi RNA等基因抑制技术的补充,可以调控细胞内的多种生化过程,在抗肿瘤的临床治疗中展现出良好的应用前景。程序性细胞死亡配体1（PD-L1）作为免疫阻断因子和血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2,KDR）在肿瘤发生中发挥重要作用,但它们对细胞内因子或通路的调控很少使用高度特异性的策略,如细胞内抗体（胞内抗体）。靶向PD-L1和VEGFR-2的双特异性胞内抗体在肿瘤治疗中可能具有重要的治疗潜力,但此前未见报道。在此,本论文基于抗体的重链可变区（VH）的氨基酸序列,设计了一种新型的同时针对PD-L1和VEGFR-2的胞内抗体FAP1V2。PCR、激光共聚焦显微镜和Western blot检测结果显示FAP1V2在人宫颈癌He La细胞中成功表达。随后,通过免疫荧光分析、流式细胞术、免疫共沉淀和抗体竞争等手段,证实FAP1V2与PD-L1或VEGFR-2的特异性结合并阻断。通过荧光配体竞争和细胞划痕实验,证实了FAP1V2介导PD-L1/PD-1的结合阻滞和抑制癌细胞迁移。利用PD-L1和VEGFR-2的双特异性胞内抗体FAP1V2,研究了PD-L1和VEGFR-2因阻断而引起的转录组异常,发现了一系列显著差异表达的新因子,揭示了细胞内可能受PD-L1和VEGFR-2调控的新的细胞内信号通路。综上所述,本研究设计了一种双特异性的胞内抗体FAP1V2,它同时靶向PD-L1和VEGFR-2,使靶蛋白的生物功能失活,并可能抑制其迁移和锚定到细胞表面,从而阻断下游反应。通过PD-L1抗体的VH结构域抑制He La细胞表面PD-1与PD-L1的结合,通过VEGFR-2抗体的VH结构域抑制He La细胞的迁移。通过转录组分析,发现抑制癌细胞迁移的PCDHs、UCN和MXRA8因子上调,促进癌细胞迁移的DDR2和PI16因子下调。本研究通过阻断PD-L1和VEGFR-2同时调控的癌症相关通路,为癌症治疗提供了一种新的双特异性胞内抗体。
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