研究背景麻黄-附子与麻黄-杏仁是麻黄汤类方的经典药对,代表方分别为麻黄附子细辛汤和三拗汤。麻黄-附子,温肺散寒,助阳解表;麻黄-杏仁,宣降相宜,解表平喘,两药对均属“相使为用”配伍范畴。然而,麻黄-附子“一攻一补”、麻黄-杏仁“一刚一柔”配伍特点与其“减毒增效”作用机制尚缺乏科学的阐释。麻黄、杏仁和附子均为有一定毒副作用的药材,麻黄草提取物及其制剂因为确切的不良反应而被FDA禁止使用,国内外服用杏仁、附子中毒甚至死亡案例时有发生。药物体内过程决定药物在血液和靶部位浓度,进而影响药理效应。因此,开展药对麻黄-附子和麻黄-杏仁配伍前后药动学、组织分布及排泄特征等体内过程研究,将有助于阐明配伍减毒增效的体内作用机制,为指导临床药物监测,促进合理用药提供科学依据。研究目的结合麻黄-附子与麻黄-杏仁药对化学成分、药理作用等课题组前期工作基础,通过分析两药对配伍前后效应成分血浆动力学、组织分布和排泄方面的特征,探讨其配伍与毒／效成分之间量(药物剂量)-效和构(药物组成)-效关系,验证和丰富药对麻黄-附子与麻黄-杏仁“相使为用”及可能存在的“相畏(相杀)”的配伍关系,从药物体内过程丰富药对“减毒增效”科学内涵。主要包括如下研究内容：(1)麻黄-附子药对配伍血浆药动学、组织分布及排泄特征研究；(2)麻黄-杏仁药对不同配比的效应成分的变化规律研究；(3)麻黄-杏仁药对不同配比的急性毒性及其交互作用分析；(4)麻黄-杏仁药对配伍血浆药动学、组织分布及排泄特征研究；(5)不同存在形式苦杏仁苷的细胞毒性及苦杏仁苷体内代谢的初步研究。研究方法1 不同生物样本中麻黄-附子和麻黄-杏仁药对效应成分分析方法的建立根据确立的效应成分,建立同时测定大鼠生物样品(血浆、组织、尿液和粪便)中麻黄-附子药对11种生物碱,即去甲麻黄碱(Norephedrine)、去甲伪麻黄碱(Norpseudoephedrine,NPE)、麻黄碱(Ephedrine, E)、伪麻黄碱(Pseudoephedrine,PE)、甲基麻黄碱(Methylephedrine,ME)、乌头碱(Aconitine, AC)、新乌头碱(Mesaconitine, MA)、次乌头碱(Hypaconitine,HA)、苯甲酰乌头原碱(Benzoylaconine,BAC)、苯甲酰新乌头原碱(Benzoylmesaconine, BMA)、苯甲酰次乌头原碱(Benzoylhypaconine, BHA)以及麻黄-杏仁药对中NE、NPE、E、PE、ME、苦杏仁苷和野樱苷的超高效液相串联三重四级杆质谱(UPLC-MS/MS)定量方法,并依据生物样本分析方法学的指导原则开展方法学验证。2麻黄-附子药对配伍效应成分体内过程的研究根据急性毒性和前期药效学的研究结果,选择麻黄-附子1：1(原方配比)开展体内过程研究。参考《伤寒论》中麻黄附子细辛汤煎煮方法,通过现代临床剂量折算,确定麻黄-附子药对的制备方法,具体如下：称取麻黄120 g,附子220 g,加水8000mL,麻黄浸泡30 min,先用武火煎煮,煮沸30 min后加入附子,调文火保持微沸再煎煮70 min,过滤后减压浓缩至适宜浓度,得到受试药物。参照课题组前期方法对受试药物中效应成分进行含量测定。2.1麻黄-附子药对配伍的血浆药动学研究大鼠分别灌胃麻黄、附子和麻黄-附子1：1受试药物溶液,于给药后预定的时间点采集全血并分取血浆。采用所建立的UPLC-MS/MS方法测定大鼠血浆中相应的效应成分,绘制不同成分的药物浓度-时间曲线,计算药代动力学参数。2.2麻黄-附子药对配伍药物的组织分布特征研究大鼠分别灌胃麻黄、附子和麻黄-附子1：1受试药物溶液,于给药后预定的时间点处死并分取心、肝、脾、肺、肾、脑组织。采用所建立的UPLC-MS/MS方法分别测定大鼠不同组织的相应的效应成分,绘制不同成分的组织分布轮廓特征图,计算药物组织动力学参数。2.3麻黄-附子药对配伍药物的排泄特征研究大鼠分别灌胃麻黄、附子和麻黄-附子1：1受试药物溶液,于给药后收集预定时间段内的尿液和粪便样本。采用所建立的UPLC-MS/MS方法分别测定大鼠尿液和粪便药物浓度,绘制不同成分的药物累计排泄曲线,计算药物排泄动力学参数。3麻黄-杏仁药对不同配比急性毒性及其交互作用评价参考《太平惠民和剂局方》中三拗汤的煎煮方法,通过现代临床剂量折算,确定麻黄-杏仁药对的制备方法,具体如下(以单副药计)：称取麻黄9 g,杏仁9 g,加水220 mL,先将上述药材浸泡30 min。武火煮沸后保持文火微沸煎煮60 min,四层纱布滤出药液；药渣再加入水160 mL,续煎60 min,合并两次药液,浓缩至适宜体积后一次性冻干。固定生药总量一致,浮动药物配比,依次制备麻黄-杏仁4：1、2：1、1:1、1：2、1：4受试药物。药物冻干粉以去离子水溶解,采用倍比稀释依次获得各组药物5个梯度剂量。取昆明小鼠分别灌胃去离子水、麻黄、杏仁、麻黄-杏仁4：1、2：1、1：1、1：2、1：4受试药物溶液。观察记录小鼠的行为学、死亡情况和死亡数量。依据中效原理,采用Calcusyn软件计算中效剂量(Dm)、合用指数(CI)和剂量下降指数(DRI)等交互作用参数。4麻黄-杏仁药对不同配比体外效应成分变化研究建立同时测定NE、NPE、E、PE、ME和L-苦杏仁苷、D-苦杏仁苷的高效液相色谱分析方法。冻干粉溶解,采用醇沉离心等方法平行制备3份供试样品溶液。依据所建立的方法对麻黄-杏仁不同配伍配比条件下麻黄生物碱和苦杏仁苷的溶出及变化规律进行分析。5麻黄-杏仁药对配伍效应成分体内过程的研究5.1麻黄-杏仁药对配伍的血浆药动学、组织分布与排泄特征研究根据急性毒性实验和前期药效学的研究结果,选择麻黄-杏仁1：1(原方配比)开展其效应成分的体内过程研究。大鼠分别灌胃麻黄、杏仁和麻黄-杏仁1：1受试药物溶液,于给药后预定的时间点采集全血(或收集组织、排泄物)。采用所建立的UPLC-MS/MS方法测定大鼠不同生物样本(血浆、组织、尿液和粪便)中相应的效应成分,绘制不同成分的药时曲线、组织分布特征图、累计排泄曲线,计算相关的药物动力学参数。5.2不同存在形式苦杏仁苷的细胞毒性实验研究麻黄杏仁配伍影响苦杏仁苷存在形式(差向异构化),苦杏仁苷不同构型体内存在立体选择性代谢。开展不同存在形式苦杏仁苷的细胞毒性实验是对体内过程研究的佐证和深入。通过不同时间的沸水浴,分别获得构型比100%、81.9%、68.8%和49.9% D-苦杏仁苷溶液(构型比=D-苦杏仁苷／L-苦杏仁苷+D-苦杏仁苷)；其次,采用CCK-8法对有无p-葡萄糖苷酶作用下不同构型比苦杏仁苷的细胞毒性进行检测。5.3苦杏仁苷体内代谢的初步研究采用UPLC-MS/MS对大鼠口服杏仁水提物后的血浆和尿液进行检测。通过化合物质谱特征的初步解析,对苦杏仁苷的代谢做出初步推断。研究结果1建立大鼠不同生物样本中麻黄-附子和麻黄-杏仁药对效应成分UPLC-MS/MS定量分析方法所建立的方法经专属性、线性范围、定量限、精密度、准确度、提取回收率、基质效应和稳定性验证,符合相关技术要求,适用于大鼠口服麻黄-附子和麻黄-杏仁水提物后相应效应成分血浆药动学、组织分布、尿液和粪便排泄特征的定量研究。2麻黄.附子药对配伍效应成分的体内过程研究(1)血浆中主要生物碱的达峰浓度下降,半衰期或平均滞留时间延长。AUC0-t/Dose结果表明,两药配伍虽然抑制彼此成分溶出,却相对提升了麻黄生物碱和苯甲酰乌头原碱的生物利用度。(2)各生物碱在肺组织有较高浓度的分布。配伍后各生物碱在吸收和分布速度加快(血浆和组织Tmax下降),同时减少各生物碱在组织中的达峰浓度和生物利用度(Cmax/dose、AUC0-t/dose下降),加速其从组织中的清除(CLz/F升高),其中双酯型的HA在各组织中的表观分布容积(Vz/F)和滞留时间(MRT0-t)增加,清除率下降。(3)尿液排泄和粪便排泄分别是麻黄生物碱和乌头生物碱的主要排泄途径。配伍对麻黄生物碱排泄参数没有显著改变。HA和单酯型生物碱(苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱)的排泄半衰期减少。HA的排泄率增加,单酯型生物碱排泄率下降。3麻黄-杏仁药对不同配比有明显的急性毒性拮抗作用杏仁的急性毒性大于麻黄,麻黄-杏仁药对不同配比组半数致死量均大于杏仁,表明麻黄与杏仁配伍提升了其用药的整体安全性。药物交互作用分析表明,麻黄和杏仁不同比例的配伍,均有明确的急性毒性拮抗作用(CI>1),且麻黄比例越高,其拮抗作用越强。除麻黄-杏仁1：4,杏仁配伍麻黄后,其剂量下降指数降幅在37%～669%,麻黄的剂量下降指数增幅在6%～57%,拮抗作用主要降低了杏仁的DRI。该结果表明,麻黄杏仁配伍后整体安全性的提升与配伍过程中麻黄拮抗杏仁的毒性有关。4麻黄-杏仁药对不同配伍配比改变了苦杏仁苷的存在形式除麻黄-杏仁1：1,配伍对麻黄生物碱和苦杏仁苷的溶出没有显著影响。但却显著促进D-苦杏仁苷的溶出,改变了苦杏仁苷的存在形式。麻黄比例越高,D-苦杏仁苷溶出比例越大。相关性分析表明,急性毒性拮抗作用与苦杏仁苷存在形式密切相关。5麻黄-杏仁药对配伍效应成分的体内过程研究尽管配伍减小了麻黄和杏仁的实际给药剂量,却相对不改变麻黄生物碱并且提高苦杏仁苷、野樱苷的生物利用度。麻黄促进D-苦杏仁苷溶出,但同时又抑制其体内吸收、分布和代谢过程。此外,杏仁也加快麻黄生物碱的体内吸收和清除。具体表现为：(1)配伍后麻黄生物碱的血浆AUC0-t/Dose没有显著变化(P>0.05),而达峰时间(Tmax)、表观分布容积和滞留时间普遍减小。(2)配伍减少了麻黄生物碱在心、肝、脾和肺组织中的吸收程度(AUC0-t/dose或／和Cmax/dose下降)和NE的血药浓度,加快它们的清除。(3)配伍后苦杏仁苷和野樱苷的血浆AUC0-t/Dose增加,却显著降低代谢产物D-野樱苷在各组织中分布含量和吸收水平(AUC0-t/dose和／或Cmax/dose减小)。(4)配伍后野樱苷尿药排泄率明显增加。6苦杏仁苷立体选择性代谢是杏仁配伍麻黄毒性拮抗的部分机制麻黄-杏仁药对水提物中D-苦杏仁苷含量高于L-苦杏仁苷,但其代谢产物D-野樱苷的浓度却远小于L-野樱苷,即苦杏仁苷口服后存在立体选择性药代动力学特征。通过与杏仁对比分析,证实配伍麻黄后能促进这一特征的继续发生(即L-/D野樱苷比例增加),进而从一定程度阻断或延缓着D-苦杏仁苷的代谢过程。为进一步佐证药动学研究中的发现和设想,本研究还开展了不同存在形式苦杏仁苷的细胞毒性实验,研究结果也从反面证实了该研究设想。因此,麻黄-杏仁药对配伍后,苦杏仁苷的立体选择性代谢是配伍毒性拮抗的部分作用环节,从一定层面上说明麻黄杏仁配伍相杀减毒的可能。7苦杏仁苷体内代谢的初步分析基于苦杏仁苷立体选择性代谢在麻黄-杏仁配伍减毒的新发现,研究对苦杏仁苷的体内代谢进行了初步分析。结果表明,苦杏仁苷除脱糖降解产生次生苷野樱苷外,还存在着氰基羟化进而转化为酰胺和羧酸类化合物的代谢可能。氰基代谢是苦杏仁苷毒性的关键环节,可能存在酰胺化代谢途径,进一步拓展了苦杏仁苷毒性的体内处置机制。研究结论1麻黄-附子药对配伍相辅相制的配伍特点麻黄附子配伍可彼此抑制其效应成分的溶出,减小其血浆、组织达峰浓度,加速它们在各脏器组织中的清除,减少了单酯型乌头生物碱的排泄率。效应成分溶出抑制、体内药物达峰浓度下降可能是配伍减毒前提,而血浆清除半衰期延长、麻黄生物碱、苯甲酰乌头原碱生物利用度相对增加和附子单酯型生物碱排泄率下降是其体内维持较好的镇痛抗炎效果的可能原因。麻黄-附子药对配伍相辅之中亦有相制之意。然而,麻黄-附子药对急性毒性和镇痛效应的协同剂量区间有重叠性。麻黄-附子药对可延缓大部分生物碱在血浆中滞留时间。同时,双酯型次乌头碱在各组织中表观分布容积、滞留时间增加且清除率的普遍减小。结果提示麻黄附子合用是否应注意其潜在的用药风险,有待于进一步研究。2麻黄-杏仁药对配伍相使之中亦有相杀之意麻黄杏仁配伍在止咳平喘药效协同的情况下,减小麻黄和杏仁的用药剂量,从而降低麻黄生物碱和苦杏仁苷的实际摄入剂量。配伍相对不影响麻黄生物碱的生物利用度的同时减少了麻黄生物碱在心、肝、脾和肺组织中的吸收程度和去甲基麻黄碱的血药浓度,加快它们的清除,降低了组织蓄积的风险。配伍相对提高苦杏仁苷和野樱苷的生物利用度,尽管伴随D-苦杏仁苷溶出过程增加,但同时也促进了苦杏仁苷立体选择性代谢和野樱苷整体排泄率增加,进而抑制其代谢产物D-野樱苷其在组织分布和代谢水平,一定程度阻断或延缓氢氰酸的产生过程。研究表明,麻黄与杏仁配伍,相使之中亦有相杀之意,丰富了两药配伍“宣降相宜,互制其偏”减毒增效的科学内涵。