在世界范围内,结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是发病率居于第三位的恶性肿瘤,每年有超过1233000人发病,以及超过608000人死于结直肠癌。在我国,结直肠癌的发病率逐年上升,已经成为了临床最常见的消化道恶性肿瘤之一。就目前而言,手术是治疗结直肠癌最有效的方法,但是在过去30年里,虽然手术技术有了先进的改进,早期诊断技术得到了提高,但病死率的变化却非常小。在初诊患者中,中、晚期癌占大多数,只有75%-80%已确珍的患者能够施行根治性手术,5年生存率也仅为60%左右。肿瘤的发生发展是一个复杂的过程,肿瘤周围的多种不同细胞,通过自分泌和旁分泌机制产生各种各样的分子,构成微环境,与肿瘤相互作用微调,促进肿瘤的发生发展。1979年,Senger首先报道了恶性转化的上皮细胞可分泌一种磷酸化糖蛋白,即骨桥蛋白(Osteopontin, OPN), OPN是富含天冬氨酸和唾液酸残基的可分泌糖蛋白,包含有多种功能域。通过与整合素和CD44受体的结合,OPN可介导细胞与基质的相互作用及细胞内信号转导。骨桥蛋白调节正常的生理过程,包括骨吸收,促进伤口愈合,组织重塑,免疫反应和血管形成,并在各种病理生理条件下发挥作用,如心肌坏死,再狭窄,动脉粥样硬化和自身免疫性疾病。研究表明,骨桥蛋白在癌症发展的各个阶段包括肿瘤的侵袭,血管生成和转移均起到重要作用。最近的报告显示,在肿瘤周围的间质细胞,骨桥蛋白也过度表达,这表明它肿瘤间质相互作用过程中发挥了重要作用并导致癌症的发展。多个文献报道显示,在多种类型的癌症肿瘤组织和血清中均发现骨桥蛋白高表达。此外,在肿瘤中增强骨桥蛋白的表达可以增加生长和转移,表明骨桥蛋白可以作为各种癌症一个诊断和预后的生物标志物。OPN基因及其相关因子是防治肿瘤的潜在靶点。然而,OPN在结直肠癌中的作用及机制目前尚不完全清楚,我们检测了OPN在结直肠腺瘤—癌进程中的表达,以了解OPN在结直肠癌形成中的作用。在体外培养的结肠癌细胞株HT-29,通过质粒转染或RNA干扰等技术上调或下调OPN表达,观察其对肿瘤细胞生物学行为的影响,同时检测多个肿瘤相关因子的表达,并对OPN在结直肠肿瘤中可能的作用机制进行了初步探讨。第一部分骨桥蛋白在结直肠腺瘤--癌进程中的表达为检测OPN结直肠腺瘤--癌进程中的表达,我们收集了原发性结直肠癌标本60例、正常肠黏膜标本60例(取自同一肿瘤标本距肿瘤边缘10cm处正常黏膜),以及结肠镜切除结直肠腺瘤50例。所有标本均经病理组织学证实,无其他肿瘤病史。所有患者治疗前均未经过放疗、化疗。结直肠腺瘤标本中含有19例低级别上皮内瘤变和31例高级别上皮内瘤变。我们首先提取腺癌、腺瘤及正常对照黏膜组织的总RNA和总蛋白,应用RT-PCR和Western Blot方法,分别检测OPN在不同组织中mRNA和蛋白的表达水平；利用免疫组织化学技术,观察OPN蛋白在腺癌、腺瘤和正常黏膜组织中的表达。RT-PCR结果显示,OPN mRNA在腺瘤及腺癌中的表达水平明显高于正常黏膜组织,而且OPNmRNA水平与上皮恶性程度呈正相关。与之相反,在所有正常结直肠黏膜组织中基本不能检测到OPNmRNA。与此一致,Western Blot结果显示,OPN蛋白表达水平在腺瘤及腺癌中明显高于正常黏膜中的表达。免疫组织化学结果显示,OPN阳性染色主要位于细胞浆中,正常黏膜组织中绝大部分细胞呈OPN阴性染色。而腺瘤标本中的OPN的表达阳性率显著高于于正常黏膜组织。且随着腺瘤级别恶性程度的升高,高级别上皮内瘤变阳性率高于低级别上皮内瘤变,结直肠腺癌OPN表达阳性率又高于腺瘤。以上结果表明,OPN在结直肠腺瘤-癌进程中,随着上皮细胞不典型增生程度加重,OPN表达水平显著升高,表明OPN可能在上皮向恶性肿瘤转化过程中起到重要作用。第二部分OPN对结肠癌细胞生长和迁移的影响尽管研究表明,OPN在多种肿瘤组织表达增高,但OPN在结直肠肿瘤中的作用及作用机制仍不完全明确。为研究OPN在结直肠肿瘤细胞中的作用,我们利用人结肠癌HT-29细胞系作为体外模型,研究OPN在结直肠癌中的作用。我们分别将OPN knock-down(KD)及OPN表达质粒转染于人结肠癌细胞株HT-29,以检测上调和下调OPN在结肠癌细胞中的作用。Western blot检测结果表明,转染OPN表达质粒的结肠癌细胞中的OPN表达水平显著高于对照组。转染OPN-KD质粒的结肠癌细胞中的OPN表达水平显著低于对照组。我们分别从细胞活力、增殖和迁移和体内成瘤几方面研究OPN在结肠癌细胞中的作用。首先,我们用MTT检测OPN对结肠癌细胞活力的影响。结果显示,与对照组相比,降低OPN表达明显抑制结肠癌细胞的生长。相反地,过表达OPN则促进了结肠癌细胞的活性。进而,我们采用细胞克隆形成率的方法来评价OPN对结肠癌细胞长期增殖的影响。结果显示,降低OPN表达明显降低结肠癌细胞克隆形成率；与之相反,过表达OPN则提高结肠癌细胞克隆形成率。以上结果提示,OPN高表达促进了结肠癌细胞的生长和增殖。肿瘤细胞除无限的生长增殖外,向正常组织浸润、侵袭是它的另一显著特点。通过细胞划痕实验,我们检测了OPN对结肠癌细胞迁移能力的影响。结果显示,降低OPN抑制了细胞的迁移；与此相反,过表达OPN促进了结肠癌细胞的迁移。最后,通过体内裸鼠成瘤实验,我们检测了OPN对结肠癌细胞成瘤能力的影响,结果显示,降低OPN抑制了细胞的体内成瘤能力；与此相反,过表达OPN促进了结肠癌细胞的体内成瘤能力。总之,OPN高表达促进结肠癌细胞的生长、增殖和迁移和体内成瘤能力,反之,下调OPN表达抑制了结肠癌细胞的生物学活性。第三部分OPN表达对结肠癌细胞肿瘤相关因子的影响众多研究资料显示,基质金属蛋白酶-9(Matrix metallopeptidase9, MMP-9)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、纤维母细胞生长因子2(Fibroblast Growth Factor, FGF-2)、环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2, COX-2)在肿瘤新生血管形成,侵袭和肿瘤细胞的生长中发挥重要作用。我们采用与第二部分相同的结肠癌细胞模型及同样的OPN调节模式,探讨OPN表达变化对结肠癌细胞MMP-9, VEGF, FGF-2, COX-2的影响。用Western blot方法分别检测OPN表达上调或下调时MMP-9, VEGF, FGF-2, COX-2蛋白的表达水平。本研究结果显示,降低OPN表达明显抑制MMP-9, VEGF, FGF-2, COX-2等肿瘤相关因子的表达,上调OPN出现相反的效应。此结果提示,OPN表达与多种肿瘤因子呈正相关关系,其对结肠癌细胞的影响至少一部分通过影响MMP-9, VEGF, FGF-2, COX-2等肿瘤相关因子发挥作用。总之,我们揭示了OPN在结直肠腺瘤-癌进程中渐进的高表达,并且OPN高表达促进结肠癌细胞的生长和迁移,下调OPN表达有相反地效应。进而,我们也证实了OPN在结肠癌细胞中对一些肿瘤相关因子的影响,可能通过此机制对结肠癌肿瘤发生发展发挥作用。鉴于OPN在结直肠癌中的作用,OPN基因及其相关因子是防治肿瘤的潜在靶点。