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第一部分胡桃醌对恶性黑色素瘤细胞生物学行为的影响[实验目的]探究胡桃醌(Juglone,Jug)对恶性黑色素瘤细胞系的生物学行为的影响及相关机制的初步探究。[实验方法]采用噻唑蓝(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,MTT)法检测Jug对A375、A2058恶黑细胞的生长抑制率并计算IC50值。流式细胞仪检测Jug对恶黑细胞的周期及凋亡影响。蛋白免疫印迹法(Weastem blot,WB)检测Jug对恶黑细胞干预后凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及周期相关蛋白CyclinDl表达的影响。划痕实验和Transwell小室实验检测Jug对黑色素瘤细胞侵袭及迁移的影响。[实验结果与结论]Jug对A375、A2058恶黑存在明显抑制增殖作用,且存在明显的时间及浓度依赖,24h IC50值分别为:3.31μg/mL、2.81μg/mL;48h IC50值为:2.33μg/mL、2.16μg/mL。Jug可以通过增加促凋亡蛋白Bax表达及减少抗凋亡蛋白Bcl-2表达诱导A375、A2058恶黑细胞凋亡。Jug可以通过影响周期相关蛋白CyclinD1的表达将A375、A2058恶黑细胞周期阻滞于G0/G1期。Jug可以明显降低A375、A2058恶黑细胞侵袭及迁移能力。第二部分胡桃醌-PLGA纳米粒制备及抑瘤作用评价[实验目的]制备胡桃醌-聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)纳米粒,考察其理化性质。评价其对恶性黑色素瘤细胞系A375及裸鼠皮下的抑瘤作用及相关安全性考察。[实验方法]采用乳化挥发法制备Jug-PLGA-NPs,对其粒径、包封率、载药率以及体外释放特征进行考察。荧光显微镜观察PLGA-NPs在体外细胞的摄取情况,小动物活体成像仪观测PLGA-NPs在BALB/c荷瘤裸鼠尾静脉注射后体内的分布。用MTT法比较Jug-PLGA-NPs与Jug对A375恶黑细胞增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡率。构建A375裸鼠皮下瘤模型,评价Jug及Jug-PLGA-NPs的抑瘤作用,处死后对内脏组织进行组织形态观察,对肿瘤组织行CyclinD1蛋白免疫组化检测并分析。[实验结果与结论]制备的Jug-PLGA-NPs平均粒径为149.6nm,包封率为68.39%,载药率5.07%,具有良好的缓释特征。PLGA-NPs在体外细胞摄取和体内活体成像中具有良好的穿透和靶向性能。不同浓度Jug-PLGA-NPs均能明显抑制A375细胞增殖、促进细胞凋亡,且呈明显时间浓度依赖(P<0.05),且48h时略优于等浓度Jug。动物实验中Jug与Jug-PLGA-NPs均展现出良好的抑瘤效果,而纳米粒组抑瘤作用更好且小鼠耐受性更佳。结论:负载Jug的PLGA纳米微粒制备简便,具有良好的药物缓释、肿瘤靶向及体内外抗肿瘤能力,且生物安全性尚可,为未来Jug的临床应用提供了一种新的药物剂型。