论文部分内容阅读
紫杉醇(paclitaxel，PTX)是从红豆杉属植物的树皮中提取得到的二萜类化合物，用于卵巢癌、乳腺癌、非小细胞性肺癌、黑素瘤、头颈癌等的治疗。临床上主要使用的是紫杉醇注射剂，商品名为TaxoL，由于缺乏靶向性，毒副作用较大。脂质体作为药物载体具有靶向、低毒和缓释等优点，PEG化脂质体能阻碍血浆成分对脂质体表面的吸附，从而降低网状内皮系统对脂质体的摄取，延长体内循环时间，经过表面配体修饰的PEG化脂质体，还可特异性地将药物主动靶向到目标细胞，减少药物对正常细胞的损害。肿瘤新生血管的生成对肿瘤发生、发展和转移起着重要作用，其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factors,VEGF)是刺激肿瘤新生血管生成最强的生长因子之一，对生理性和病理性的血管发生都起着重要的作用；VEGF-2与血管内皮细胞上高表达的VEGFR-2或KDR结合能促进内皮细胞增殖和肿瘤新生血管的生成。含有12个氨基酸的多肽K237(序列为HTMYYHHYQHHL)能够特异性地与血管内皮细胞上的KDR受体结合，阻断VEGF与KDR结合所产生的生物学效应，研究发现在肿瘤细胞表面也存在KDR高表达的现象。本课题用K237修饰脂质体，以紫杉醇作为模型药物，以期构建主动靶向于肿瘤新生血管和肿瘤细胞的药物载体。本课题采用NH2末端PEG化技术合成靶向脂质材料DSPE-PEG-K237，以DSPE-PEG-K237、大豆卵磷脂和胆固醇为膜材，采用薄膜分散法制备K237修饰的紫杉醇长循环靶向脂质体(K237-PTX-Lip)，以包封率和粒径为主要考察指标优化K237-PTX-Lip的处方和制备工艺。优化的处方为：胆固醇与卵磷脂的比例为1/10，紫杉醇与卵磷脂的比例为1/50，脂质材料浓度为4.0%，DSPE-PEG-K237占处方磷脂总量为5mol%。采用优化后的工艺制备得到的K237-PTX-Lip和PTX-Lip包封率分别为(93.01±0.89)%和(97.95±1.32)%；粒径分别为(78.2±6.1)nm和(54.6±4.7)nm，电荷分别为-38.7mv和-40.9mv。采用MTT法、激光共聚焦显微成像和流式细胞仪技术评价K237修饰的紫杉醇脂质体和荧光素脂质体对SKOV-3和HUVEC细胞的靶向性。MTT实验结果显示，将不同浓度的PTX制剂作用于SKOV-3和HUVEC细胞72h后，K237-PTX-Lip在1.0nmol L-1时开始显示出对SKOV-3毒性，而在此浓度下TaxoL和PTX-Lip对SKOV-3没有毒性，随着PTX浓度的增加，K237-PTX-Lip显现出较TaxoL和PTX-Lip更强的增殖抑制作用。PTX终浓度在3~5nmol L-1时，K237-PTX-Lip显示出较TaxoL和PTX-Lip更强的抑制HUVEC细胞增殖的作用。当PTX浓度为5nmol L-1时，作用72h对HUVEC抑制率达30%，但对SKOV-3抑制作用却不显著，即PTX在非细胞毒浓度下，表现出明显的抗HUVEC增殖的能力。K237-PTX-Lip对SKOV-3和HUVEC的半数抑制浓度(IC50)分别为25.06nmol L-1和8.81nmol L-1，是PTX-Lip的0.336倍和0.695倍；MTT细胞毒实验表明，与普通脂质体相比，K237修饰的脂质体有更强的细胞毒性。激光共聚焦显微成像技术观察到SKOV-3和HUVEC给予PTX-Lip24h后，细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；给予K237-PTX-Lip24h后，细胞核裂解为碎块，产生许多凋亡小体，表明细胞对K237-PTX-Lip摄取的显著增强，并且这一作用可被游离K237阻断。流式细胞仪结果表明，与未修饰的脂质体相比，表面K237修饰的脂质体能促进细胞对脂质体的摄取，且这种作用能被游离K237阻断。体外细胞学评价结果显示以K237多肽修饰的脂质体具有良好的细胞靶向性，明显增强SKOV-3和HUVEC对脂质体的摄取。