目的:　　近年来，我国肺癌发病率呈快速增长趋势。目前临床上缺乏特异的、敏感的肺癌早期诊断以及治疗性分子靶标。肿瘤干细胞(Cancer stem cell，CSC)被认为是肿瘤产生、发展、复发、转移的根源，寻找肺癌干细胞有可能成为其早期诊断和治疗的新的突破点。大量研究表明微小RNA(microRNA，miRNA)广泛参与了肿瘤的发生、发展、转移、复发、血管生成和耐药等，识别肺癌或肺癌干细胞相关的miRNA有可能成为肺癌早期诊断的重要策略。分子信标是一种分子内互补形成发卡结构的荧光标记的寡核苷酸序列，是一个非常敏感的检测DNA、RNA和microRNA的方法，已被广泛用于基因定量分析、疾病诊断和活体成像等研究领域。壳聚糖作为一种天然阳离子多糖，被广泛用于介导质粒、小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)等基因转染。体内外实验均证实壳聚糖纳米(Chitosan，CS)可介导基因转染，且具有较高的安全性和有效性。本课题组前期以壳聚糖纳米作为载体转染质粒DNA并取得了较理想的结果。由于不同组织的高通透性和滞留效应(Enhanced permeability and retention effect，EPR)存在差距，利用纳米材料的被动靶向策略通常达不到较理想的靶向效果;而肿瘤细胞表面有很多特异性的受体或抗原可以用来区分正常细胞，可以通过将纳米材料表面偶联具有特异性的多肽和单克隆抗体，使之与癌细胞表面的抗原或受体特异性结合，从而实现对肿瘤细胞的靶向性诊断与治疗，生长抑素受体2(somatostatin receptor2，SSTR2)就是其中的代表。因此，本研究拟以非小细胞肺癌(non-small sell lungcancer，NSCLC)为疾病模型，从A549肺癌细胞系中分选CD133+CD326+双阳性细胞并验证其是否为肺癌干细胞（lung cancer stem cell，LCSC），而后采用分子信标(molecular beacon，MB)技术和纳米技术相结合，并进行靶向多肽奥曲肽(Octreotide，OCT)偶联，利用OCT可以与细胞表明的SSTR2受体特异性结合这一特点，通过识别肺癌细胞或肺癌干细胞中高表达的microRNA达到识别肺癌细胞或肺癌干细胞的目的，为肺癌的诊断提供新思路、新方法和新技术。　　方法:　　1.通过流式细胞仪从A549细胞中分选出CD133+CD326+双阳性细胞并对其干性进行鉴定，采用荧光定量PCR方法检测miR-155的表达。　　2.根据miR-155序列设计并合成锁核酸修饰的miR-155分子信标(miR-155 MB)，同时设计阴性对照，即不和任何基因序列结合的随机序列(random sequence，RS)分子信标，采用液相分子杂交实验检测设计的miR-155 MB和RS MB分子信标的特异性及灵敏性。　　3.采用自组装方法合成壳聚糖miR-155分子信标纳米(CS-miR-155 MB)并对其粒径大小、zeta电位、分散度、抗DNaseⅠ等理化性质进行检测。以壳聚糖纳米做为载体转染miR-155MB，同时以RS MB作为阴性对照，激光共聚焦显微镜检测miR-155MB对NSCLC细胞及LCSC中miR-155的识别功能并成像，并采用实时荧光定量PCR方法进行验证，以PC-3细胞作为阳性对照;进一步在皮下移植瘤和肺移植瘤活体动物水平上检测CS-miR-155 MB对NSCLC细胞及LCSC中miR-155的识别功能并成像。同时以商品化的脂质体siPORT试剂作为载体转染miR-155MB，通过检测荧光强度和转染效率比较壳聚糖纳米和脂质体作为miR-155MB载体对miR-155的检测及成像功能。　　4.免疫荧光技术检测NSCLC细胞及皮下移植瘤组织中SSTR2的表达，同时采用化学修饰方法制备靶向奥曲肽偶联的壳聚糖分子信标纳米复合物(CS-MB-OCT)并对其理化性质进行检测。在细胞水平上、皮下移植瘤和肺移植瘤活体动物水平上检测CS-MB-OCT对NSCLC细胞中miR-155的识别功能并成像，并通过检测荧光信号强度及流式细胞仪分析转染效率来比较商品化的脂质体siPORT转染试剂、CS-MB及CS-MB-OCT三者作为miR-155MB载体对miR-155的检测及成像功能。　　结果:　　1.分选的CD133+CD326+双阳性细胞在干细胞培养基中成球生长，在细胞数为1×104数量下仍具备成瘤能力，干性相关基因CD133、CD326、OCT-4、Nanog表达为A549细胞的3倍之上，miR-155的表达为A549细胞的2.63倍。　　2.液相分子杂交实验中miR-155+miR-155MB组荧光强度为miR-155MB组的55倍，RS+RS MB组的荧光强度为RS MB组的41倍，表明设计的锁核酸修饰的miR-155MB能够很好的识别miR-155，具有较高的特异性和灵敏性。　　3.按照7∶1的质量比合成CS-MB，其粒径范围在15-80nm，平均粒径31.95±3.28nm，zeta电位+20.1±2.14mv，能够抵抗DNaseⅠ的降解;孵育细胞24小时后细胞存活率仍在90％以上，适合基因转染。在细胞水平上，CS转染miR-155 MB后可在NSCLC细胞及LCSC细胞浆中看到较强的红色荧光，且荧光信号强弱趋势与荧光定量PCR检测的miR-155的表达趋势一致，RS MB组未检测到荧光信号。在活体动物水平上，CS转染miR-155 MB后能够在NSCLC皮下移植瘤组织中检测到较强的红色荧光，RS MB组未检测到荧光信号。壳聚糖纳米转染效率在各组细胞之间约为75％-85％，和商品化的siPORT脂质体转染试剂相比，具有较高的荧光信号和转染效率。　　4.免疫荧光检测发现SSTR2在NSCLC细胞及皮下移植瘤组织中都有表达，可作为奥曲肽特异结合的定向靶标。采用化学修饰方法以戊二醛为交联剂合成CS-MB-OCT，其粒径范围为30-130 nm，平均粒径为82.28±1.24 nm。在细胞水平上，CS-miR155 MB-OCT能够发挥其靶向作用，和肿瘤细胞表面的SSTR2特异性结合，对NSCLC细胞中miR-155的识别功能并成像，孵育时间更短，需1小时，转染效率约为90％-95％，红色荧光信号更强，CS-RS MB-OCT组未检测到荧光信号。在皮下移植瘤和肺移植瘤活体动物水平上，CS-miR155 MB-OCT能够实现对NSCLC皮下移植瘤及肺移植瘤组织中肿瘤细胞的miR-155识别并成像，与CS-miR155 MB相比，荧光信号和转染效率更高。　　结论:　　1.从A549细胞中分选的CD133+CD326+双阳性细胞具有干细胞特性，并高表达miR-155。设计的锁核酸修饰的miR-155 MB能够特异性的识别miR-155并具有较高的灵敏性。　　2.合成的CS-miR-155 MB纳米复合物能够在细胞水平、皮下移植瘤和肺移植瘤动物水平上对NSCLC细胞或LCSC中的miR-155进行识别并成像，通过识别NSCLC细胞或LCSC中高表达的miR-155对肿瘤细胞进行成像。　　3.和CS-miR155 MB纳米复合物相比，合成的CS-miR155 MB-OCT纳米复合物能够发挥其靶向作用，和肿瘤细胞表面的生长抑素受体特异性结合，在细胞水平、皮下移植瘤和肺移植瘤活体动物水平上更好的对NSCLC细胞中的miR-155进行识别并成像，为肺癌的诊断提供了新思路、新方法和新的实验依据。