脂联素是由脂肪组织分泌的细胞因子,与糖尿病、肥胖和代谢综合征等密切相关,在心血管疾病、癌症、非酒精性脂肪肝等多种疾病的病程中发挥着积极的保护作用。脂联素在体内有单体、三聚体、高聚体以及球型核心区域等多种存在形态,且不同形态的功能和作用方式不尽相同。其中,脂联素高聚体由18个或更多单体通过尾部交联聚合而成,在多方面具有最强的生物学活性。因脂联素高聚体空间结构较为复杂,一直未能够在体外获得,极大限制了其相关研究。鉴于此,本研究尝试以纳米微球为载体,在体外构建一种具备生物学活性的脂联素高聚体模型。研究中首先制备具有锚定功能的脂联素融合蛋白;然后优选兼具生物相容性和降解性的高分子聚合材料,并将其制备成稳定性好、分散性强的纳米级微球颗粒;最后,将融合蛋白与纳米微球孵育结合,通过脂联素融合蛋白尾部的锚定作用,将数个单体蛋白聚集,模拟脂联素高聚体结构。随后对其生物活性进行验证并进一步挖掘脂联素高聚体的生物学功能。研究取得如下结果:1、独创性的设计融合蛋白和脂联素高聚体模型。融合蛋白中引入具有延展性的链接序列使得脂联素功能区域更利于分布于纳米微球表面。根据生物信息学分析,融合蛋白结构和特性符合设计预期,具备有效锚定于纳米微球表面并展现完整生物学活性的可行性。2、构建了四个表达体系用于获得目的蛋白。为了获得活性和产量均优异的目的蛋白,研究中构建了目前应用最为广泛的四个表达体系。经过多次不同方法的筛选,最终确定以杆状病毒-昆虫表达系统合成目的蛋白。经检测,脂联素和融合蛋白表达量分别为1.8和2.3 mg/L,生物活性优良。3、制备纳米微球及高聚体模型。优选6种生物相容性和降解性优异的高分子聚合材料,通过溶剂挥发法和超声乳化法制备纳米级微球。然后在多种复合条件下制备数种高聚体模型,并以粒径、Zeta电位以及扫描电镜检测、筛选,最终通过PLA、PLGA和PHB三种材料得到符合试验要求的高聚体模型。4、细胞和动物试验证实脂联素高聚体模型具有基本的生物学活性。通过在ob/ob小鼠中对NF-κB和AMPK等指标的检测验证以及细胞试验的辅助证明,确认成功构建了两种具有脂联素高聚体生物学活性的聚合体模型。5、探讨脂联素高聚体与AKT激活的作用关系。通过对AMPK、PI3K、T-钙黏蛋白和AKT等指标的检测分析,确定了脂联素单体和脂联素高聚体对AKT激活的影响。脂联素单体既可激活AMPK(主要通路),也可激活PI3K,并从两个方向激活AKT;而脂联素高聚体则显著地通过活化PI3K从而激活AKT。6、探讨脂联素高聚体和T-钙黏蛋白表达的联系。在ob/ob小鼠骨骼肌和内皮细胞中,脂联素和脂联素高聚体均可温和的促进T-钙黏蛋白表达,脂联素较微弱,脂联素高聚体略强。研究证实,通过脂联素融合蛋白和纳米微球复合得到的脂联素高聚体模型具备相应的生物学功能,模型构建成功,为脂联素高聚体的后续研究提供支持。