本研究首先采用质粒共转染和竞争性RT-PCR方法对本组从HTLV-I活化的人外周血T淋巴细胞MATCHMAKERcDNA文库中筛选到的NRE结合蛋白ITF2B在Jurkat细胞、B3D5细胞及BJAB细胞中对IL-2Rα基因的启动子活性的影响进行了研究，并应用染色质免疫沉淀(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)技术对ITF2B在Jurkat细胞中与IL-2Rα基因启动子区染色质的结合状态进行了研究；其次，应用酵母单杂交体系从HTLV-1活化的人外周血T淋巴细胞MATCHMAKERcDNA文库中筛选得到了四个潜在的NIRS结合蛋白。对潜在的NIRS结合蛋白，先用凝胶迁移率变更实验(Electrophoresismobilityshiftassay，EMSA)证实了其中三个在体外能与NIRS序列特异结合，采用质粒共转染和竞争性RT-PCR方法研究了NFκBactivatingprotein和TTF-I△N320对IL-2Rα基因的启动子活性的影响。为了更明确NRE和NIRS元件在IL-2Rα基因调控中的作用，我们还对NRE和NIRS的核心序列进行了定点突变，并构建了带不同IL-2Rα基因启动子(野生型和不同突变型)的报告基因质粒。 一、NIRS样元件结合蛋白的筛选、同源性分析及DNA结合结构域分析以合成的NIRS四联体序列介导的报告质粒为“诱饵”，应用酵母单杂交体系从HTLV-1活化的人外周血T淋巴细胞MATCHMAKERcDNA文库中筛选到了四个潜在的NIRS的结合蛋白。BLASTN和BLASTP分析表明，1号阳性克隆(1＃)的插入片段与人transposon-derivedBusterltransposase-likeprotein基因cDNA有99％的同源性，编码的多肽与相应的蛋白质的一致性为96％；2号阳性克隆(2＃)的插入片段与人的Ku抗原(70kD)(Homosapiensthyroidautoantigen70kDa(Kuantigen))cDNA有100％的同源性，编码的多肽与相应的蛋白质的一致性为96％；4号阳性克隆(4＃)的插入片段与人RNA聚合酶Ⅰ的转录终止因子(Homosapienstranscriptionterminationfactor,RNApolymeraseⅠ(TTF-Ⅰ))的cDNA有99％的同源性；编码的多肽与相应的蛋白质的一致性为87％；24号阳性克隆(24＃)的插入片段与人一个可能的NFkB激活蛋白(HomosapiensputativeNFkBactivatingprotein)cDNA有99％的同源性；编码的多肽与相应的蛋白质的一致性为92％。 对插入片段编码的多肽序列可能的DNA结合结构域进行分析。结果发现：编码与Ku抗原C-端330个氨基酸残基同源的克隆(2＃)含有两个保守的DNA结合结构域：Ku78和SAP结构域；编码与RNA聚合酶Ⅰ的转录终止因子(TTF-Ⅰ)C-端582个5氨基酸残基同源的克隆(4＃)含有两个保守的SANT结构域。SAP结构域和SANT结构域都是DNA结合结构域，它们的功能和染色质重塑有关。 二、NIRS结合蛋白功能的初步研究1.NIRS结合蛋白与NIRS序列的体外结合活性我们将三个阳性克隆(Ku70△N284，TTF-I△N320，NFκBAP△N342)的插入片段克隆到真核表达载体pcDNA6/Flag中构建真核表达质粒。Western印迹检测的结果表明，这些真核表达质粒转入HeLa细胞后可表达带Flag标签的融合蛋白。用表达了融合蛋白的全细胞抽提物与32P标记的带NIRS样元件的寡核苷酸探针做凝胶迁移率变更实验，结果表明，三个阳性克隆插入片段的融合蛋白在体外均能与NIRS样元件特异结合。 2.NIRS结合蛋白TTF-I△N320对IL-2Rα基因启动子活性的影响TTF-I△N320为TTF-I的截短形式，其C-末端含有两个SANT结构域。将其真核表达质粒与不同的IL-2Rα基因启动子(野生型，NRE突变，NIRS突变或双突变)驱动的报告基因质粒及内参照质粒pM-CAT瞬时共转染Jurkat细胞，然后用竞争性RT-PCR方法分析IL-2Rα基因启动子活性。结果发现，TTF-I△N320可明显地降低野生型和NRE突变的IL-2Rα基因启动子活性，而对NIRS突变或双突变的IL-2Rα基因启动子活性没有影响。这提示TTF-I△N320对IL-2Rα基因启动子活性的负调控作用依赖NIRS的存在。 3.NIRS结合蛋白NFκBactivatingprotein对IL-2Rα基因启动子活性的影响将真核表达质粒pcDNA6/Flag-NFκBAP与不同的IL-2Rα基因启动子驱动的报告基因质粒及内参照质粒pM-CAT瞬时共转染Jurkat细胞，然后应用竞争性RT-PCR方法分析IL-2Rα基因启动子活性。结果显示，NFκBactivatingprotein对IL-2Rα基因野生型或不同突变型启动子组成性活性都没有明显的影响，而且对其PHA的诱导活性也没有明显的影响。这提示NFκBactivatingprotein可能对IL-2Rα基因启动子活性没有影响。 三、NRE结合蛋白ITF2B对IL-2Rα基因启动子活性的影响1.ITF2B在Jurkat细胞中对IL-2Rα基因启动子活性的影响将ITF2B表达质粒分别与受IL-2Rα基因转录起始点上游不同长度(4k、1.6k、0.5k、0.5kmNRE(NRE核心序列突变)和0.3k)启动子序列驱动的报告基因质粒(pREP4m-4k-CAT，pREP4m-1.6k-CAT，pREP4m-0.5k-CAT，pREP4m-0.5kmNRE-CAT，pREP4m-0.3k-CAT)及内参照质粒pM-CAT瞬时共转染Jurkat细胞，然后应用竞争性RT-PCR方法分析IL-2Rα基因启动子活性。结果显示，在Jurkat细胞中ITF2B蛋白可使4k,1.6k,0.5k启动子的组成性活性降低50％，而对NRE突变或NRE删除的IL-2Rα基因的启动子活性没有明显的影响。这说明在Jurkat细胞中ITF2B可负调控IL-2Rα基因的启动子活性，而且这种负调控作用是NRE依赖的。 2.ITF2B在B3D5细胞中对IL-2Rα基因启动子活性的影响将ITF2B表达质粒与IL-2Rα基因不同长度启动子序列驱动的报告基因质粒及内参照质粒pM-CAT瞬时共转染B3D5细胞，然后应用竞争性RT-PCR方法分析IL-2Rα基因启动子活性。结果显示，在B3D5细胞中ITF2B蛋白可使4k,1.6k,0.5k启动子的组成性活性降低50％，而对NRE突变或NRE删除的IL-2Rα基因的启动子活性没有明显的影响。这说明在B3D5细胞中ITF2B可负调控IL-2Rα基因的启动子组成性活性，而且这种负调控作用是NRE依赖的。 3.ITF2B在BJAB细胞中对IL-2Rα基因启动子活性的影响将ITF2B表达质粒与受IL-2Rα基因不同长度启动子序列驱动的报告基因质粒和内参照质粒pM-CAT瞬时共转染BJAB细胞，然后应用竞争性RT-PCR方法分析启动子活性。结果显示，与转染空载体的对照组相比，ITF2B在BJAB细胞中对IL-2Rα基因启动子活性没有明显影响。 在Jurkat细胞中，IL-2Rα基因呈组成性表达，而且可被很多刺激因子诱导表达；B3D5细胞为一由EB病毒转化可表达IL-2Rα链的的B细胞株；BJAB细胞是不表达IL-2Rα链的B淋巴细胞。ITF2B在Jurkat和B3D5细胞中可以明显地降低IL-2Rα基因启动子的组成性活性，而在BJAB细胞中则不起作用。说明这种负调控作用具有细胞特异性，负调控作用的发挥依赖NRE的存在。 4.ITF2B在Jurkat细胞中对IL-2Rα基因启动子区染色质的结合特性应用染色质免疫沉淀技术对ITF2B在Jurkat细胞中的结合状况进行了研究。ChIP7结果显示，在Jurkat细胞中ITF2B可结合于IL-2Rα基因启动子区染色质的NRE位点。这说明ITF2B在细胞内确实可与IL-2Rα基因的负调控元件NRE结合，从而对IL-2Rα基因起负调控作用。