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本文以我国北方海水养殖肉食性鱼类牙鲆(Paralichthys olivaceus)和大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)为研究对象,进行基于气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)的高糖负荷后牙鲆血清代谢组学研究,以及不同饲料糖脂比对大菱鲆瘦素及其受体和脂联素受体基因表达影响的研究。主要研究内容和结果如下：1.高糖负荷后牙鲆血清代谢组学研究本研究采用基于气相色谱-质谱联用技术的代谢组学研究方法,分析两种不同糖耐量实验(腹腔注射葡萄糖和口腔灌喂葡萄糖)后牙鲆(225±50g)血清中代谢物变化。结果显示,两种不同实验方式对牙鲆血糖、血清胰岛素以及代谢变化影响存在很大差异。牙鲆腹腔注射葡萄糖(500mg/ml,1g/kg体重)后,血糖水平在5h达到峰值(20.06±1.92mM),24h时血糖与0h无显著差异(P>0.05)；血清胰岛素水平在葡萄糖注射后急剧下降,在3h达到最低(1.58±0.21mIU/L),在24h时恢复原值(3.03±0.06mIU/L);与0h相比,注射葡萄糖后3h血清中有6种代谢物水平显著上调(P<0.05),分别为：塔罗糖、木糖、异麦芽糖、半乳糖醛酸、羟基脲和环己烯四醇β环氧化物;到第5h血清中有9种代谢物水平显著上调(P<0.05),分别为：塔罗糖、木糖、异麦芽糖、黄嘌呤、乳酸、乌头酸、茉莉酮酸甲酯、环己烯四醇β环氧化物和肾上腺皮质酮；3h与5h的血清中只有1种差异代谢物皮质酮(P<0.05)。牙鲆口腔灌喂葡萄糖(500mg/ml, 1.67g/kg体重)后,血糖水平在3h达到最大值(1.90±0.23mM),7h恢复至原来水平(0.89±0.04mM)；而血清胰岛素水平在3h上升至3.37±0.34mIU/L,5h时恢复至原水平(2.56±0.41mIU/L);与0h相比,灌喂葡萄糖后3h时牙鲆血清中显著上调的代谢物有5种(P<0.05),分别是：塔罗糖、乳酸、3-羟邻氨基苯甲酸、黄嘌呤和次黄嘌呤；但在5h时血清中没有显著增多的代谢物,只有1种代谢物半乳糖酸含量显著下降(P<0.05),而5h时血清中有2种代谢物水平显著低于3h(P<0.05),这2种代谢物是木糖和3-羟邻氨基苯甲酸。此外,我们还对上述2种不同方式糖负荷后同一时间点的血清代谢物进行了比对,结果显示在高糖负荷后3h,注射组血清中有4种代谢物水平显著高于灌喂组(P<0.05),分别是：塔罗糖、异麦芽糖、环己烯四醇p环氧化物和邻羟基苯丙酸；5h时注射组血清中有6种代谢物含量显著高于灌喂组(P<0.05),分别是塔罗糖、异麦芽糖、木糖、环己烯四醇β环氧化物、乌头酸和半乳糖酸,但有1种代谢物N-氨甲酰谷氨酸含量显著低于灌喂组(P<0.05)。经KEGG数据库比对,以及参考已有报道分析得出,这些差异代谢物表明牙鲆可以通过多种糖代谢途径进行血糖水平的调节,包括糖酵解、三羧酸循环、糖原合成、戊糖与葡萄糖醛酸互变以及戊糖磷酸途径,同时氨基酸代谢和肠道微生物的代谢也会对血糖变化产生响应,间接起到加速血糖水平下调的作用。值得注意的是血清中邻羟基苯丙酸和N-氨甲酰谷氨酸水平与机体内瘦素、胰岛素、胰高血糖素和生长抑素等激素水平有一定相关性,这两种代谢物以及皮质酮水平的变化表明,皮质酮、瘦素、胰岛素、胰高血糖素和生长抑素等激素可能在牙鲆体内各糖代谢途径中起到一定的调控作用。2.大菱鲆瘦素及其受体、脂联素受体基因序列全长克隆和分析在本研究中,利用分子克隆和RACE技术克隆到了大菱鲆瘦素(LEP)及其受体(LEPR)和脂联素两种受体(AdipoR1和AdipoR2) cDNA序列全长。大菱鲆LEP cDNA序列全长1126bp,共编码157个氨基酸。大菱鲆LEP氨基酸序列与人的LEP同源性很低,只有18.8%,但它们预测的三级结构保守性却很高。大菱鲆LEPR cDNA序列全长4248bp,共编码1173个氨基酸,大菱鲆LEPR氨基酸序列与人的同源性为28%,与点带石斑鱼的同源性为82%,在脊椎动物中保守存在的所有重要功能域在该序列中均有发现。组织差异表达结果显示大菱鲆LEP主要在脑、眼和肝脏中表达,LEPR主要表达的场所是肝脏和肾脏。大菱鲆AdipoR1核苷酸序列全长1125bp,共编码375个氨基酸,其氨基酸序列与其他脊椎的同源性都很高,人为80%,罗非鱼为97%。大菱鲆AdipoR2核苷酸序列全长1940bp,共编码380个氨基酸,氨基酸序列与其他脊椎动物同源性也都很高,人为78%,罗非鱼为92%。蛋白跨膜结构域预测得出大菱鲆AdipoRl和AdipoR2都具有7个明显的跨膜区,最优拓扑模型为N端在细胞内侧模型,与其他脊椎动物相同。大菱鲆AdipoR分布广泛,AdipoR1在鳃和肾中表达水平最高,AdipoR2则在鳃、胃、肠、肾和幽门盲囊中的表达量都较多,但在肌肉中表达量较少。3.不同饲料糖脂比对大菱鲆瘦素及其受体、脂联素受体基因表达的影响本研究配制不同糖脂比(1：6、1：2、2：1和14：1)的饲料,养殖大菱鲆9周后,利用荧光实时定量PCR技术检测了大菱鲆肝脏中瘦素,肝脏和肌肉中瘦素受体和脂联素受体基因的表达量。结果显示,饲料糖脂比从l：6升高到2：1对瘦素和瘦素受体基因表达没有产生显著影响(P>0.05),但在糖脂比上升到14：1时,肝脏瘦素表达量显著升高(P<0.05),而肝脏瘦素受体的nRNA水平却显著低于对照组(P<0.05),与其他2组无显著差异(P>0.05),此时肌肉中瘦素受体的mRNA水平最高,显著高于其他3组(P<0.05)。饲料糖脂比的变化没有对肝脏中AdipoR的表达产生显著影响(P>0.05),然而,与糖脂比为1：6的对照组相比,大菱鲆肌肉中AdipoR1的表达量在1：2的处理组显著下调(P<0.05),但与其他2组无显著差异(P>0.05)。饲料糖脂比的变化对肌肉中AdipoR2的表达没有产生显著影响(P>0.05)。该研究结果表明饲料中糖水平变化会对大菱鲆瘦素与脂联素作用产生显著影响。