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Mx基因是Lindenmann在研究A2G小鼠对流感病毒具有天然抵抗力这一现象时发现,因能抵抗黏液病毒而命名为Mx(Myxovirus-resistant)基因,即抗黏液病毒基因。
Mx蛋白属于大GTPase的Dynamin超家族,在体内由I型干扰素(IFN)诱导。大多数的脊椎动物有1到3个不同细胞内定位的Mx蛋白异构体,一般定位于核内或胞质中。Mx蛋白具有广谱的抗病毒能力,对许多RNA病毒,如流感病毒、水泡性口炎病毒、狂犬病毒等都有抗性,甚至对DNA病毒,如乙型肝炎病毒也有一定的作用。目前对于Mx基因的研究主要集中于人MxA和小鼠Mxl基因。关于禽类Mx蛋白的研究,1992年首次发现了鸭的Mx蛋白后,鸡的Mx蛋白基因也被克隆,鸡的Mx蛋白的抗病毒活性受第631位氨基酸的影响,当该位氨基酸为天冬酰胺时有抗病毒活性,为丝氨酸时则无抗病毒活性。迄今为止,有关鸡的Mx基因表达以及蛋白抗新城疫病毒活性和机制方面的研究不多。
本研究从本研究团队已构建的质粒中克隆出了鸡Mx基因,经测序正确后,将其克隆入pET32a载体,获得了含Mx基因的重组质粒。将该重组质粒转化到大肠杆菌株BL21(DE3)中并用IPTG于30℃诱导重组质粒中Mx基因获得了表达,表达产物为包涵体。经过表达条件的优化,选择确定了重组Mx蛋白高效表达的最适参数,即当IPTG浓度为1.0mmol/L、诱导时间为4h时表达水平最高。诱导菌液裂解物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,初步确证了His-Mx融合蛋白的表达,表达的鸡Mx融合蛋白分子量约为90kDa。将包涵体溶解于8mol/L的尿素中,利用His·Bind试剂盒获得纯化的蛋白。对纯化后的蛋白采用透析复性的方法复性,Westernblot结果显示,纯化的Mx蛋白能与Mx多克隆抗体起反应,该融合蛋白获得了成功表达。采用VSV-CEF系统初步检测Mx蛋白抗病毒活性,结果显示抗病毒活性约为2.7×106IU/L。应用新城疫病毒抑制试验,结果发现,表达的Mx对病毒具有强的抑制作用,Mx蛋白具有明显抗新城疫病毒的活性。
将Mx基因克隆入真核表达载体pEGFP-C1,重组表达载体经PCR、酶切鉴定验证构建成功后,提取并纯化重组质粒。采用磷酸钙法转染HEK293T细胞,RT-PCR、细胞荧光亚定位与Western blot鉴定其表达。然后从转染的HEK293T细胞中提取并纯化Mx蛋白,采用NDV-CEF微量细胞抑制试验,进一步确定Mx蛋白的抗病毒活性。结果表明,对鸡Mx基因进行PCR和酶切鉴定,构建了能够正确表达鸡Mx蛋白的重组真核表达载体质粒。Western blot结果显示,在约为105kDa出现特异性条带。微量细胞抑制试验结果显示,重组Mx蛋白具有较强的抗新城疫病毒活性。