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桔小实蝇Bactroceradorsalis(Hendel)是最具入侵性和多食性的害虫之一，为害250多种水果和蔬菜作物，造成严重损失。桔小实蝇的高入侵性原因取决于多方面因素，如寄主范围广、繁殖力强、扩散能力强、对环境胁迫压力的快速适应性等。对寒冷环境的适应可能是其地理扩张的一个关键因素之一。在环境胁迫条件下，昆虫肠道共生菌被证明可显著提高宿主的环境适应性。然而，在长期的低温胁迫下，肠道微生物对宿主适应性的作用仍不清楚。本文旨在研究明确肠道微生物在协助宿主桔小实蝇抗10℃低温胁迫中的功能，筛选鉴定其关键肠道共生细菌，并通过转录组学和代谢组学关联分析和功能研究，阐明肠道微生物影响宿主桔小实蝇成虫抵抗低温胁迫的分子机制。
1.肠道微生物增强宿主桔小实蝇成虫对低温胁迫的抵抗力
首先研究了肠道共生菌在桔小实蝇成虫抵抗低温胁迫中的作用。结果表明，通过抗生素处理去除肠道菌群后，将桔小实蝇暴露于10℃的低温胁迫中，中位生存时间显著降低至正常种群组桔小实蝇的约68％。通过回补筛选，我们发现KlebsiellamichiganensisBD177是影响桔小实蝇成虫抗寒性的一种关键共生细菌，通过回补实验，其在抗生素清菌处理(ABX)的桔小实蝇中重新定殖，可以显著延长宿主的生存时间，比ABX组生存时间延长了160％，使它们的寿命恢复到了正常种群在10℃的水平。通过经典微生物培养方法和qPCR分析表明，K.michiganensisBD177能够在肠道内重新定殖和维持，并在暴露于10℃后的整个生命中有益于宿主健康。K.michiganensisBD177回补、重新定殖的ABX桔小实蝇，与ABX桔小实蝇相比，血淋巴中的总氨基酸和脂质水平也分别显著增加了170％和300％。这些研究结果表明，在10℃下宿主寿命的延长和生理机制的改善，与肠道微生物群落有关，其中K.michiganensisBD177是宿主桔小实蝇抗寒性的关键肠道共生菌。
2.肠道微生物对受低温胁迫的桔小实蝇代谢组和转录组响应的影响
为了评估肠道微生物对受低温胁迫的桔小实蝇代谢组和转录组响应的影响，我们通过转录组学和代谢组学分析，比较研究桔小实蝇正常种群组、ABX组和K.michiganensisBD177回补组在10℃低温胁迫的差异基因和代谢产物及其通路。代谢组学分析的结果表明，桔小实蝇正常种群组、ABX组和K.michiganensisBD177回补组血淋巴中总共检测到1548种代谢物，包括氨基酸，多种脂质及其衍生物和碳水化合物。此外，差异表达代谢物的分析表明，正常种群组与ABX组中201种代谢物，K.michiganensisBD177回补组与ABX组中202种代谢物显著富集，其中有133种代谢物在两次比较中均显著富集。与ABX桔小实蝇相比，在K.michiganensisBD177回补或正常种群桔小实蝇中，组氨酸、脯氨酸、精氨酸、鸟氨酸和腐胺等氨基酸显著上调，表明这些代谢物在10℃的低温胁迫下被宿主吸收。然而，与ABX桔小实蝇相比，甘油和磷脂(例如LysoPE)和肉碱衍生物(例如L-乙酰肉碱和L-棕榈酰肉碱)，以及糖(包括果糖，依贡醇葡糖苷)在正常种群和K.michiganensisBD177回补桔小实蝇中均显著下调。在富集的途径中，精氨酸和脯氨酸代谢以及单萜类生物合成途径是两组中最显著富集的途径。转录组分析结果表明，在正常种群组与ABX组中共有18,576个差异表达基因(DEG)，在K.michiganensisBD177回补组与ABX组之间共鉴定了10,760个DEG。在这些显著富集的基因中，有8306个DEG在两次比较中均有显著富集。在本研究中，与低温抗性相关的几种DEG编码为热激蛋白蛋白(HSPs)、锌指蛋白(ZFPs)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STKs)以及精氨酸和脯氨酸代谢酶(APMs)。基因富集分析表明，最常见的DEG富集到代谢途径，包括核糖体、寿命调节途径、内质网中的蛋白质加工、精氨酸和脯氨酸代谢途径、D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢途径等。
3.肠道共生菌通过刺激桔小实蝇成虫的精氨酸和脯氨酸代谢途径促进宿主对低温胁迫的抗性
我们通过转录组和代谢组关联分析，发现了“精氨酸和脯氨酸代谢”在转录组和代谢组中均有显著富集。值得注意的是，暴露于10℃低温度胁迫下，相比于正常桔小实蝇，ABX组桔小实蝇血淋巴中脯氨酸和精氨酸代谢产物的相对水平分别显著下调了34倍和10倍，而K.michiganensisBD177回补组与ABX组桔小实蝇血淋巴相比，BD177显著上调了宿主脯氨酸和精氨酸的水平，分别为13倍和10倍。qPCR分析则证实，与ABX相比，K.michiganensis回补显著刺激了精氨酸和脯氨酸代谢途径基因的转录表达。RNAi介导的两个关键基因吡咯啉5-羧酸还原酶(Pro-C)和精氨酸琥珀酸合酶(ASS)沉默，显著减少了正常桔小实蝇暴露于低温胁迫后的生存时间。我们将L-精氨酸和L-脯氨酸显微注射入ABX桔小实蝇后，暴露于10℃的温度胁迫后，它们的存活时间显著增加。透射电子显微镜(TEM)分析进一步揭示，低温导致ABX桔小实蝇肠道中的线粒体严重破坏，导致线粒体呈异常圆形形状，而K.michiganensisBD177重新定殖有助于ABX桔小实蝇保持线粒体形状和功能，与正常状态无差异。此外，与ABX桔小实蝇相比，K.michiganensis重新定殖的桔小实蝇显著提高了肠道组织中的ATP浓度达377％，这表明在低温胁迫下肠道共生菌在维持线粒体正常代谢机制中起着至关重要的作用。综合这些结果表明肠道微生物通过刺激宿主精氨酸和脯氨酸代谢途径、影响线粒体功能来增强宿主桔小实蝇对低温胁迫的抵抗力。
4.桔小实蝇精氨酸和脯氨酸代谢关键基因的特征及表达分析
我们进一步研究了桔小实蝇精氨酸和脯氨酸代谢关键基因的特征及表达模式。根据在宿主发育和在低温胁迫下对生存的保护作用，选择了以下基因；吡咯啉5-羧酸还原酶(Pro-C)，鸟氨酸脱羧酶(ODC)，鸟氨酸氨基转移酶(OAT)，精氨酸酶(Arg)和精氨酸激酶(AK)。五个桔小实蝇APM的开放阅读框的长度分别为815、1178、1283、1067和1172bp，分别编码271、392、427、355和520个氨基酸。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析表明，成虫的ODC，OAT，Arg和AK转录本更为丰富，而Pro-C的转录本水平在孵化1d的幼虫中最高。包括ODC，OAT和Arg三种转录本在脂肪体内的表达分别比其他组织高36倍，41倍和133倍，而Pro-C和AK在肠道和睾丸中大量表达。在0℃进行冷休克处理3小时后，Pro-C，OAT和Arg的mRNA表达水平分别显著上调了2.30，1.92和4.22倍，而仅在10℃进行处理之后，与正常处理条件(27℃)相比，ODC的表达则显著提高了1.52倍。表明这些基因在暴露于极端温度胁迫下的桔小实蝇具有重要作用。
综上结果表明，肠道微生物在促进宿主桔小实蝇抵抗低温胁迫的中起着重要的作用；其中肠道共生菌K.michiganensisBD177是其关键共生菌，可以帮助宿主桔小实蝇维持线粒体的动态平衡，并促进其代谢功能，提高精氨酸和脯氨酸的水平，增强桔小实蝇对低温胁迫的抗性，即肠道微生物通过刺激宿主精氨酸和脯氨酸代谢途径、影响线粒体功能来增强宿主对低温胁迫的抵抗力。这些结果揭示了肠道微生物影响宿主桔小实蝇抗寒性及其通过刺激宿主精氨酸和脯氨酸代谢途径、影响线粒体功能来调控宿主抗寒性的分子机制，不仅为阐明昆虫与其肠道微生物互作机制和协同进化规律以及入侵害虫的环境适应机制奠定了重要的理论基础，而且为靶向肠道共生菌的害虫防治提供新策略、新思路，因此具有重要的科学意义和实践价值。
1.肠道微生物增强宿主桔小实蝇成虫对低温胁迫的抵抗力
首先研究了肠道共生菌在桔小实蝇成虫抵抗低温胁迫中的作用。结果表明，通过抗生素处理去除肠道菌群后，将桔小实蝇暴露于10℃的低温胁迫中，中位生存时间显著降低至正常种群组桔小实蝇的约68％。通过回补筛选，我们发现KlebsiellamichiganensisBD177是影响桔小实蝇成虫抗寒性的一种关键共生细菌，通过回补实验，其在抗生素清菌处理(ABX)的桔小实蝇中重新定殖，可以显著延长宿主的生存时间，比ABX组生存时间延长了160％，使它们的寿命恢复到了正常种群在10℃的水平。通过经典微生物培养方法和qPCR分析表明，K.michiganensisBD177能够在肠道内重新定殖和维持，并在暴露于10℃后的整个生命中有益于宿主健康。K.michiganensisBD177回补、重新定殖的ABX桔小实蝇，与ABX桔小实蝇相比，血淋巴中的总氨基酸和脂质水平也分别显著增加了170％和300％。这些研究结果表明，在10℃下宿主寿命的延长和生理机制的改善，与肠道微生物群落有关，其中K.michiganensisBD177是宿主桔小实蝇抗寒性的关键肠道共生菌。
2.肠道微生物对受低温胁迫的桔小实蝇代谢组和转录组响应的影响
为了评估肠道微生物对受低温胁迫的桔小实蝇代谢组和转录组响应的影响，我们通过转录组学和代谢组学分析，比较研究桔小实蝇正常种群组、ABX组和K.michiganensisBD177回补组在10℃低温胁迫的差异基因和代谢产物及其通路。代谢组学分析的结果表明，桔小实蝇正常种群组、ABX组和K.michiganensisBD177回补组血淋巴中总共检测到1548种代谢物，包括氨基酸，多种脂质及其衍生物和碳水化合物。此外，差异表达代谢物的分析表明，正常种群组与ABX组中201种代谢物，K.michiganensisBD177回补组与ABX组中202种代谢物显著富集，其中有133种代谢物在两次比较中均显著富集。与ABX桔小实蝇相比，在K.michiganensisBD177回补或正常种群桔小实蝇中，组氨酸、脯氨酸、精氨酸、鸟氨酸和腐胺等氨基酸显著上调，表明这些代谢物在10℃的低温胁迫下被宿主吸收。然而，与ABX桔小实蝇相比，甘油和磷脂(例如LysoPE)和肉碱衍生物(例如L-乙酰肉碱和L-棕榈酰肉碱)，以及糖(包括果糖，依贡醇葡糖苷)在正常种群和K.michiganensisBD177回补桔小实蝇中均显著下调。在富集的途径中，精氨酸和脯氨酸代谢以及单萜类生物合成途径是两组中最显著富集的途径。转录组分析结果表明，在正常种群组与ABX组中共有18,576个差异表达基因(DEG)，在K.michiganensisBD177回补组与ABX组之间共鉴定了10,760个DEG。在这些显著富集的基因中，有8306个DEG在两次比较中均有显著富集。在本研究中，与低温抗性相关的几种DEG编码为热激蛋白蛋白(HSPs)、锌指蛋白(ZFPs)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STKs)以及精氨酸和脯氨酸代谢酶(APMs)。基因富集分析表明，最常见的DEG富集到代谢途径，包括核糖体、寿命调节途径、内质网中的蛋白质加工、精氨酸和脯氨酸代谢途径、D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢途径等。
3.肠道共生菌通过刺激桔小实蝇成虫的精氨酸和脯氨酸代谢途径促进宿主对低温胁迫的抗性
我们通过转录组和代谢组关联分析，发现了“精氨酸和脯氨酸代谢”在转录组和代谢组中均有显著富集。值得注意的是，暴露于10℃低温度胁迫下，相比于正常桔小实蝇，ABX组桔小实蝇血淋巴中脯氨酸和精氨酸代谢产物的相对水平分别显著下调了34倍和10倍，而K.michiganensisBD177回补组与ABX组桔小实蝇血淋巴相比，BD177显著上调了宿主脯氨酸和精氨酸的水平，分别为13倍和10倍。qPCR分析则证实，与ABX相比，K.michiganensis回补显著刺激了精氨酸和脯氨酸代谢途径基因的转录表达。RNAi介导的两个关键基因吡咯啉5-羧酸还原酶(Pro-C)和精氨酸琥珀酸合酶(ASS)沉默，显著减少了正常桔小实蝇暴露于低温胁迫后的生存时间。我们将L-精氨酸和L-脯氨酸显微注射入ABX桔小实蝇后，暴露于10℃的温度胁迫后，它们的存活时间显著增加。透射电子显微镜(TEM)分析进一步揭示，低温导致ABX桔小实蝇肠道中的线粒体严重破坏，导致线粒体呈异常圆形形状，而K.michiganensisBD177重新定殖有助于ABX桔小实蝇保持线粒体形状和功能，与正常状态无差异。此外，与ABX桔小实蝇相比，K.michiganensis重新定殖的桔小实蝇显著提高了肠道组织中的ATP浓度达377％，这表明在低温胁迫下肠道共生菌在维持线粒体正常代谢机制中起着至关重要的作用。综合这些结果表明肠道微生物通过刺激宿主精氨酸和脯氨酸代谢途径、影响线粒体功能来增强宿主桔小实蝇对低温胁迫的抵抗力。
4.桔小实蝇精氨酸和脯氨酸代谢关键基因的特征及表达分析
我们进一步研究了桔小实蝇精氨酸和脯氨酸代谢关键基因的特征及表达模式。根据在宿主发育和在低温胁迫下对生存的保护作用，选择了以下基因；吡咯啉5-羧酸还原酶(Pro-C)，鸟氨酸脱羧酶(ODC)，鸟氨酸氨基转移酶(OAT)，精氨酸酶(Arg)和精氨酸激酶(AK)。五个桔小实蝇APM的开放阅读框的长度分别为815、1178、1283、1067和1172bp，分别编码271、392、427、355和520个氨基酸。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析表明，成虫的ODC，OAT，Arg和AK转录本更为丰富，而Pro-C的转录本水平在孵化1d的幼虫中最高。包括ODC，OAT和Arg三种转录本在脂肪体内的表达分别比其他组织高36倍，41倍和133倍，而Pro-C和AK在肠道和睾丸中大量表达。在0℃进行冷休克处理3小时后，Pro-C，OAT和Arg的mRNA表达水平分别显著上调了2.30，1.92和4.22倍，而仅在10℃进行处理之后，与正常处理条件(27℃)相比，ODC的表达则显著提高了1.52倍。表明这些基因在暴露于极端温度胁迫下的桔小实蝇具有重要作用。
综上结果表明，肠道微生物在促进宿主桔小实蝇抵抗低温胁迫的中起着重要的作用；其中肠道共生菌K.michiganensisBD177是其关键共生菌，可以帮助宿主桔小实蝇维持线粒体的动态平衡，并促进其代谢功能，提高精氨酸和脯氨酸的水平，增强桔小实蝇对低温胁迫的抗性，即肠道微生物通过刺激宿主精氨酸和脯氨酸代谢途径、影响线粒体功能来增强宿主对低温胁迫的抵抗力。这些结果揭示了肠道微生物影响宿主桔小实蝇抗寒性及其通过刺激宿主精氨酸和脯氨酸代谢途径、影响线粒体功能来调控宿主抗寒性的分子机制，不仅为阐明昆虫与其肠道微生物互作机制和协同进化规律以及入侵害虫的环境适应机制奠定了重要的理论基础，而且为靶向肠道共生菌的害虫防治提供新策略、新思路，因此具有重要的科学意义和实践价值。