论文部分内容阅读
目的：本课题通过揭示细菌治疗肿瘤的炎性机制及中药对炎症的调节，探讨了中药在细菌肿瘤治疗中的协同作用及机制，为中药联合A1-R治疗肿瘤奠定理论基础。分析人前列腺肿瘤(PC3)肿瘤细胞对A1-R细菌感染后不同时间点基因表达的变化，寻找与A1-R诱导肿瘤细胞的炎症相关基因表达。观察中药黄芪、牡丹皮和生地黄及其单体对细菌诱导肿瘤细胞的炎症相关基因表达及对细菌感染荷瘤动物的肿瘤及正常组织相关炎症因子产物的影响，探索中药联合细菌治疗肿瘤的有效性及安全性的分子基础。 方法：①体外细胞实验:采用流式细胞术观察细胞存活率，采用Agilent人基因芯片，分析A1-R感染人前列腺肿瘤(PC3)细胞不同时间点基因表达谱特征以及其差异比较分析， qRT-PCR实验观察基因的变化。运用人前列腺肿瘤PC3细胞，QRT-PCR实验检测单体丹皮酚、梓醇及黄芪甲苷对A1-R感染人前列腺癌PC3细胞炎症相关基因产生的影响;Western blot实验检测单体丹皮酚、梓醇及黄芪甲苷对A1-R感染人前列腺癌PC3细胞引起炎性因子产生的影响。②体内动物实验:观察中药黄芪、牡丹皮及生地黄对A1-R感染正常小鼠腹部出血点的影响，Western blot实验检测中药黄芪、牡丹皮及生地黄对A1-R感染正常小鼠肝组织炎症因子的影响。采用AQH-INF-3和AQM-INF-3蛋白芯片，分析A1-R感染人前列腺肿瘤(PC3)裸鼠血清、肝和瘤中炎性因子的变化。采用A1-R感染鼠乳腺癌(4T1)移植瘤小鼠模型，Western blot实验检测中药黄芪、牡丹皮及生地黄对小鼠肝、瘤组织炎性因子表达的影响。 结果：①A1-R诱导人前列腺肿瘤PC3细胞死亡，流式细胞仪分析表明细胞主要死于凋亡晚期及坏死。基因表达分析，检测A1-R感染PC3细胞0、30、60分钟三个时间点，差异基因有45个上调，及9个下调。上调基因包括与炎症密切相关的转录基因(NFKB1，FOXO3，c-fos，c-jun)和细胞因子基因(TNF-a，IL-8，IL-1a)，且通过基因相互作用网络发现NFKB1、FOXO3、c-fos、c-jun这四个炎症相关基因与A1-R诱导的肿瘤细胞炎性因子表达密切相关。②在体外PC3细胞模型中，发现中药单体丹皮酚(低浓度2 umol/L、中浓度4 umol/L、高浓度8umol/L)、梓醇（低浓度5umol/L、中浓度10 umol/L、高浓度20 umol/L）、黄芪甲苷（低浓度12.5 umol/L、中浓度25 umol/L、高浓度50 umol/L）作用2，4，8小时后，对细胞没有明显抑制作用。中药单体干预基因表达的观察发现，A1-R感染PC3细胞模型中，30分钟时，与A1-R组相比，丹皮酚使FOXO3、c-jun、NF-kB1以及IL-8、IL-1a、TNF-a基因表达下调，梓醇使IL-1a、TNF-a基因表达降低和c-jun、NF-Kb1基因表达上调，黄芪甲苷使IL-1a、TNF-a基因表达降低和c-fos基因表达上调，单体复方使下列基因表达下调FOXO3、IL-8、IL-1a、TNF-a;60分钟时，与A1-R组相比，丹皮酚使FOXO3、c-jun、NF-kB1以及IL-8、IL-1a、TNF-a基因表达上调，梓醇使c-jun、NF-kB1以及IL-8、IL-1a、TNF-a基因表达上调，黄芪甲苷使c-jun、NF-kB1基因表达下调以及IL-8、IL-1a、TNF-a基因表达上调，单体复方使FOXO3、c-jun、NF-kB1以及IL-8、IL-1a、TNF-a基因表达下调。③A1-R感染人前列腺肿瘤(PC3)荷瘤宿主，分析肝组织、瘤组织和血清中炎症因子的表达。实验发现，与control组相比，8小时时，瘤组织中6个炎性因子表达上升，血清中16个炎性因子表达显著增高，肝组织中17个炎性因子表达显著上升，瘤组织中炎性因子的表达量明显比血清和肝组织中少。A1-R感染宿主8小时时，引起的炎性反应在正常组织中表现更明显。④A1-R感染正常裸鼠宿主模型20小时，中药牡丹皮、生地黄及黄芪减少A1-R感染的裸鼠腹部出血点，且减少了肝组织IL-8、IL-1b、IL-6蛋白的表达。A1-R感染鼠乳腺癌(4T1)宿主模型上，4小时，中药牡丹皮、生地黄及黄芪使肝组织IL-1b蛋白表达减少，使瘤组织TNF-a、IL-1b蛋白表达增多;20小时，中药牡丹皮、生地黄及黄芪使肝组织TNF-a、IL-1b细胞因子表达减少，对瘤组织TNF-a、IL-1b细胞因子表达影响不明显;72小时中药牡丹皮、生地黄及黄芪对肝组织TNF-a、IL-1b蛋白表达影响不明显，使瘤组织TNF-a蛋白表达增高。 结论：本研究运用基因芯片分析揭示了A1-R通过调控多个基因位点诱导的人前列腺肿瘤PC3细胞死亡，同时伴随有多个炎症基因表达增强。炎症在细菌肿瘤治疗中扮演着一把双刃剑的作用，炎症应答参与诱导肿瘤细胞死亡，也会对机体产生炎症带来副反应。运用中药复方协同细菌的肿瘤治疗，通过调控炎症因子，增强细菌抗肿瘤作用，同时减少细菌对正常组织的影响，以达到对抗肿瘤治疗的“增效减毒”作用。