论文部分内容阅读
目的:苯并芘（Benzo（a）pyrene,BaP）是一种广为人知的致癌物,其长期慢性暴露也可通过血脑屏障在脑组织得到累积,进而对神经系统产生严重的损伤作用。研究发现苯并芘的神经毒性和其对线粒体稳态的破坏有着密切关联,因此,线粒体是苯并芘神经毒性的重要靶点。白藜芦醇（Resveratrol,RSV）是一种存在于植物和水果中的天然多酚类化合物,其在抗癌、抗氧化的同时还发挥着良好的神经保护作用。且近期研究发现白藜芦醇在不同的实验模型中可表现出对线粒体稳态的调节作用。但相关的具体分子机制并未明确。为了验证苯并芘的神经毒性是否和线粒体损伤有关以及白藜芦醇是否可以预防苯并芘所致的线粒体损伤,我们采用体外培养原代神经元构建苯并芘暴露模型,同时用白藜芦醇干预从而探索相关作用及分子机制,为预防苯并芘所致神经毒性提供重要的研究依据。研究方法:1、提取出生24 h之内的野生型C57BL/6小鼠大脑皮质神经元进行体外培养,进行神经元纯度鉴定90%以上方可进行后续实验。首先将神经元分别用0、2、4、8μM苯并芘处理0、6、12、18、24 h,5、10、20μM白藜芦醇预处理6 h,分别进行细胞活力和LDH释放检测。经上述实验选取2、4μM苯并芘处理24 h构建模型,10、20μM白藜芦醇预处理6 h干预。为了探索苯并芘是否诱导线粒体途径的神经元损伤以及白藜芦醇是否对苯并芘诱导的线粒体损伤发挥保护作用,实验分组如下:对照组、2μM苯并芘染毒组、4μM苯并芘染毒组、20μM白藜芦醇单独处理组、10μM白藜芦醇预处理+4μM苯并芘染毒组、20μM白藜芦醇预处理+4μM苯并芘染毒组。分别用于检测凋亡率,Bcl-2/Bax和Cyt-C蛋白表达水平、线粒体和细胞ROS生成、线粒体膜电位、ATP水平、线粒体网络形态完整性、线粒体生成相关蛋白和基因（PGC-1α、NRF1和TFAM）表达水平、线粒体DNA拷贝数、自噬囊泡形成、自噬相关蛋白（p62、LC3II/I、Beclin1、PINK1和Parkin）表达水平、LC3和TOMM20蛋白相互作用及线粒体和溶酶体共定位。2、为了进一步探索白藜芦醇是否通过AMPK活化保护苯并芘诱导的线粒体损伤,引入了AMPK抑制剂Compound C（CC）,实验分组如下:对照组、4μM苯并芘染毒组、20μM白藜芦醇预处理+4μM苯并芘染毒组、10μM CC单独处理组、10μM CC预处理+4μM苯并芘染毒组、10μM CC预处理+20μM白藜芦醇预处理+4μM苯并芘染毒组。其中,CC干预1 h,苯并芘处理24 h,白藜芦醇干预6 h。分别用于检测细胞活力和LDH释放、凋亡率、线粒体生成相关蛋白和基因（PGC-1α、NRF1和TFAM）表达水平、线粒体DNA拷贝数、自噬囊泡形成、自噬相关蛋白（p62、LC3II/I、Beclin1、PINK1和Parkin）表达水平、LC3和TOMM20蛋白相互作用及线粒体和溶酶体共定位。结果:1、随着苯并芘暴露剂量和时间的增加,神经元细胞活力不断下降。而白藜芦醇预处理可缓解这种损伤。据此,选择2、4μM苯并芘处理24 h和10、20μM白藜芦醇预处理干预6 h用于后续实验;苯并芘暴露24 h后,与对照组比较,各组神经元凋亡率、Bcl-2/Bax和Cyt-C蛋白表达、线粒体和细胞ROS生成、线粒体网络和个体随着苯并芘暴露剂量的增加而增加,而线粒体膜电位和ATP水平随着苯并芘暴露剂量的增加而下降;与高剂量苯并芘染毒组比较,白藜芦醇则呈剂量依赖式保护苯并芘引起的神经元细胞损伤;与对照组比较,低剂量的苯并芘促进线粒体生成和线粒体自噬（具体表现为PGC-1α、NRF1和TFAM蛋白和基因表达、线粒体DNA拷贝数、自噬囊泡形成、LC3II/I、Beclin1、PINK1和Parkin蛋白、LC3和TOMM20蛋白相互作用、线粒体和溶酶体共定位增加和p62蛋白表达下降）;相比于低剂量苯并芘染毒组,高剂量苯并芘引起线粒体生成和自噬活化障碍;与高剂量苯并芘染毒组相比,白藜芦醇干预呈剂量依赖式缓解线粒体损伤。2、与对照组比较,CC没有引起明显的细胞毒性,与20μM白藜芦醇预处理+4μM苯并芘染毒组比较,CC的干预明显降低细胞活力,说明此剂量CC可特异性作为AMPK的抑制剂用于后续实验;与20μM白藜芦醇预处理+4μM苯并芘染毒组比较,CC干预增加了神经元细胞凋亡率、LC3和TOMM20蛋白相互作用、自噬囊泡、LC3II/I、p62蛋白以及线粒体和溶酶体共定位;与20μM白藜芦醇预处理+4μM苯并芘染毒组比较,CC干预降低了线粒体生成相关蛋白和基因（PGC-1α、NRF1和TFAM）表达水平、相关蛋白磷酸化水平（AMPK、PGC-1α和ULK1）、线粒体DNA拷贝数及线粒体自噬相关蛋白（PINK1和Parkin）表达水平。结论:苯并芘可以诱导线粒体途径的神经元损伤,而白藜芦醇可以通过缓解苯并芘诱导的线粒体稳态失衡从而保护苯并芘的神经毒性。主要机制为:白藜芦醇活化AMPK/PGC-1α途径保护苯并芘暴露诱导的神经元线粒体生成障碍;白藜芦醇活化AMPK/ULK1途径调节苯并芘暴露诱导的神经元线粒体自噬活化障碍。