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乙型脑炎(简称乙脑)是一种经蚊媒传播的严重威胁人畜健康的急性传染病。猪是乙脑病毒的重要储存宿主和扩增宿主,乙脑带毒猪是该疫病的主要传染源。该病给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。本研究建立了猪乙脑病毒RT-PCR诊断方法并对分离自四川崇州猪场和内江猪场的蚊源乙脑病毒(CZ1株和NJ1株)进行PrM/E基因的序列分析,从分子水平上了解四川乙脑分离毒株的生物学特性,对JEV的诊断、预防和控制具有较大的意义。1.猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法的建立参考GenBank中收录的31株JEV E基因序列,进行相似性分析,以SA14-14-2为参照确定1725-2163区段为扩增靶序列；用Primer 5软件合成了一对引物(P1/P2),产物长度为439bp。对试验的Mg2+浓度、引物浓度、退火温度等反应条件进行优化、选择。确定了PT-PCR扩增最佳体系为：10×buffer (Mg2+-Free) 5μL,25mM Mg2+ 2.0μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10pmol上下游引物各0.8μL,5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL,DNA模板1μL,最后用无菌去离子水补至50μL。PCR扩增程序如下：94℃-5min；94℃-30S,56℃-30 S,72℃40 S,30个循环；72℃延伸10 min,4℃保存。RT-PCR特异性检测试验表明,该方法对常见的猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒扩增均无条带；敏感性检测显示,能最低检测到10pg的JEV核酸。结果表明建立了RT-PCR检测JEV方法,具有简单、快速、特异性好、灵敏性高等优点。2.四川乙脑分离株CZ1株、NJ1株PrM/E基因的序列分析采用RT-PCR扩增并克隆分离株的PrM/E区段序列,利用PrM(456-695位)区段序列与29株参考序列进行基因分型分析,并对E区段核苷酸序列与减毒活疫苗株SA14-14-2的相应序列进行比对,分析CZ1株、NJ1株与SA14-14-2氨基酸的相似性及关键结构域的差异。结果表明,CZ1株PrM(456-695位)区基因分型证实分离株属于基因Ⅰ型,E区段与SA14-14-2的核苷酸与氨基酸相似性分别为90.9%和97.2%,但在E蛋白的活性关键结构域有15个氨基酸存在差异；JEV-NJ1株PrM(456-695位)区基因分型证实分离株属于基因Ⅲ型,E区段与SA14-14-2的核苷酸与氨基酸相似性分别为99.6%和99.2%,但在E蛋白的活性关键结构域有3个氨基酸存在差异；本研究初步确定了CZl株和NJ1株的部分分子特征,对乙脑的流行病学研究及其防治具有重要意义。