蛋白质复合物的正确组装对正常行使其功能至关重要，特别是对如核糖体和多亚基的孔通道等超大蛋白质复合物而言更是如此。然而由于难以在体外重建整个过程，我们对多聚体蛋白质复合物精确自组装机理的认识严重缺乏。而成孔毒素（PFTs）从水溶性单体自组装成同源寡聚体的独特特性为我们研究自组装机理提供了一个很好地模型系统。由多种革兰氏阳性细菌分泌的胆固醇依赖溶细胞素（CDCs）是成孔毒素中的最大的家族，许多胆固醇依赖溶细胞素具有致病性。本文研究的产气荚膜梭菌溶素O（PFO）是一种由产气荚膜梭菌分泌的典型的胆固醇依赖溶细胞素。产气荚膜梭菌导致的气性坏疽可以产生很严重的临床症状。和其他成孔毒素类似，PFO的成孔过程按以下三个步骤进行：首先，PFO水溶性单体以胆固醇作为受体联结到膜上；然后，单体与单体之间相互作用自组装成未穿孔的孔前体复合物；最终，孔前体插入膜中形成孔通道。PFO能够形成一系列不同大小的孔复合物，有的孔复合物甚至包含超过50个亚基,直径超过30nm。自组装成孔过程的一个核心问题就是如此多的亚基如何同时从孔前体转变为孔复合物。例如，假设一个由50个单体构成的环状复合物，每个单体宽为2.5nm，则相互远离长达60nm的两个亚基是否可能及如何在同一时间经历完全相同的转变过程。我们尝试分别用常规AFM，新型温控Icon AFM系统和高速AFM实时观察PFO的成孔过程。通过常规AFM的实时观察，我们进一步确定弧形复合物可以在膜上稳定存在。通过高速AFM我们观察到，弧形复合物可以在膜上形成孔通道，并且当复合物被AFM探针拉拽出来之后，弧形复合物会重新联结到膜上的另一个区域重新形成孔通道。实验结果表明弧形复合物具有良好的成孔功能，从而解决了该领域内长期以来对弧形复合物成孔功能存在性的争议。由于孔复合物的尺寸分布可以为理解自组装成孔过程提供有用的信息，我们利用溶液中对PFO的高分辨AFM成像获得了前所未有的PFO孔复合物超高分辨结构信息，并对PFO孔复合物所含单体数进行了统计。我们意外的发现，PFO孔复合物所含的单体数在6的倍数处有明显的峰值，而且发现最小的孔复合物是六聚体。因此，我们认为组装/插入过程实际上更倾向于以六聚体亚复合物/中间态的形式进行，这种亚复合物的结构与较小的亚复合物不同。结合前人的研究，我们提出了如下的成孔过程模型：PFO水溶性单体首先通过胆固醇作为受体联结到磷脂膜上，膜上的PFO单体之间相互作用，依次聚集在一起，当聚集在一起的单体数达到六的时候，孔前体复合物能够获得足够的能量发生构象变化，形成一个以六聚体为峰值的分布的亚复合物中间态，随后构象变化后的亚复合物中间态插入到细胞膜内形成孔复合物，同时停止生长。由于亚复合物中间态已经是发生了构象变化，因此亚复合物中间态只能和中间态相互作用聚集在一起，而无法和未发生构象变化的寡聚物相互作用。基于此，在复合物中如何协调如此多亚基行为的难题转化为先协调六聚体内的构象变化再协调六聚体之间的构象变化来完成。这种严格按等级划分的组织结构很可能也适用于其他多成分毒素，也可能更广泛的适用于大蛋白组装和生物技术自组装成的复合物。本研究归结起来就是利用AFM高分辨成像和高速实时扫描的独特优势，从分子水平结构变化来解析PFO在膜上成孔过程中的协同效应，初步揭示了PFO成孔机理中的两大问题，第一，证实了PFO弧形复合物的成孔功能存在，第二，发现PFO成孔过程存在一个六聚体亚复合物的中间态，从而提出一个新的成孔机理模型。更进一步，我们还将通过PFO定点突变体及另两种相关蛋白，进一步探索这一模型的普适意义。该模型的确立不但为大尺度构型变化提供了一个全新的工作机制，也为设计制备功能性成孔蛋白，寻找干预靶点等提供了重要基础。