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harpin蛋白能够激发植物过敏反应(hypersensitive response,HR),但是目前对植物如何调控植物过敏反应或细胞死亡的机制尚不清楚,哪些因素可以影响harpin蛋白激发植物的过敏反应是一个困扰已久的问题。众所周知,吲哚乙酸(Indole-3-aceticacid,IAA),是最早发现的一类天然植物激素,属于生长素的一种,它参与并调控植物的许多生理活动,有证据表明生长素也参与植物的防卫反应。那么生长素是否会对harpin激发的植物过敏反应起作用?如果有,其调控机制如何?
就此问题,我们以IAA为研究对象,建立了利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定烟草和棉花叶片中生长素含量的方法。这项研究能够快速分离和定量测定烟草和棉花叶片中生长素的含量,测定结果可靠,方法具有可行性。
进一步对比6-8叶期的表达harpinXoo转基因烟草和棉花与非转基因对照植物体中的经不同实验处理后IAA的含量的差异变化,结果发现在接TMV后0-6h内,转基因烟草IAA含量随时间表现出上升趋势,而对照转空载体烟草中IAA的变化呈降低趋势。接棉花黄萎菌后0-6h内,转基因棉花IAA含量随时间表现出上升趋势,非转基因棉花IAA含量表现出下降趋势。
为什么经病原物侵染后表达harpinxoo转基因植物(烟草和棉花)IAA的含量会升高,而作为对照的非转基因植物则表现下降趋势?我们猜想:植物体内生长素含量的高低可能会影响到harpin蛋白的作用。那么,对普通烟草体外施加一定浓度的生长素会不会抑制harpin蛋白引起的过敏反应呢?带着这些问题,我们分别从烟草表型和分子生物学角度对激素对蛋白激发的HR的影响进行了进一步的研究。选用普通烟草、纯化GST融合蛋白harpinxoo、104mol/LIAA、500μM三碘苯甲酸(2,3,5-trllodobenzolcacid,TIBA,为IAA抑制剂)为主要试材,通过烟草表型观察,结果发现在表型上10-4mol/LIAA对harpinxoo在烟草叶片上激发的HR具有一定的抑制作用。分子检测方面,选取真核生物中高度保守并且为组成性表达的基因EF-1α口作为内参基因,通过半定量PCR,检测了植物过敏反应标志基因hsr203J、抗病防卫基因chia5、硝酸还原酶基因nr,以及ChtA、ChtB、GluA、GluB等20多个基因的表达情况。并重点针对hsr203J和chia5做了荧光定量PCR的检测。结果显示:当烟草叶片未经任何实验处理时hsr203J和chia5无表达,nr有表达;104mol/LIAA和500μMTIBA单独作用于烟草叶片后对上述基因的表达均无影响;harpin蛋白激发烟草叶片产生HR,hsr203J和chia5有表达,nr无表达。10-4mol/LIAA与harpin蛋白复合处理使HR作用减弱,但此时基因hsr203J的表达却略有增加,基因chia5的表达明显降低,nr仍无表达。而经500ILMTIBA处理抑制10-4mol/LIAA作用后,被IAA抑制的harpin蛋白激发的HR又能够得以部分恢复,所产生的HR斑大小介于蛋白HR斑和经104mol/LIAA和harpin蛋白复合处理的HR斑大小之间,此时hsr203J、chia5也有表达。只是基因hsr203J的表达较单独harpin蛋白作用产生HR和10-4mol/LIAA与蛋白复合处理都明显降低;基因chia5的表达却是比harpin蛋白激发烟草叶片产生HR的处理低,比经IAA和蛋白互作后表达要高,nr仍无表达。
综合烟草表型实验和分子生物学检测,最后得出结论:生长素在一定程度上可以逆转harpin蛋白在烟草叶片上激发的植物过敏反应。这为进一步更深入研究harpin激发的HR的调控机制奠定了一定的理论基础。
就此问题,我们以IAA为研究对象,建立了利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定烟草和棉花叶片中生长素含量的方法。这项研究能够快速分离和定量测定烟草和棉花叶片中生长素的含量,测定结果可靠,方法具有可行性。
进一步对比6-8叶期的表达harpinXoo转基因烟草和棉花与非转基因对照植物体中的经不同实验处理后IAA的含量的差异变化,结果发现在接TMV后0-6h内,转基因烟草IAA含量随时间表现出上升趋势,而对照转空载体烟草中IAA的变化呈降低趋势。接棉花黄萎菌后0-6h内,转基因棉花IAA含量随时间表现出上升趋势,非转基因棉花IAA含量表现出下降趋势。
为什么经病原物侵染后表达harpinxoo转基因植物(烟草和棉花)IAA的含量会升高,而作为对照的非转基因植物则表现下降趋势?我们猜想:植物体内生长素含量的高低可能会影响到harpin蛋白的作用。那么,对普通烟草体外施加一定浓度的生长素会不会抑制harpin蛋白引起的过敏反应呢?带着这些问题,我们分别从烟草表型和分子生物学角度对激素对蛋白激发的HR的影响进行了进一步的研究。选用普通烟草、纯化GST融合蛋白harpinxoo、104mol/LIAA、500μM三碘苯甲酸(2,3,5-trllodobenzolcacid,TIBA,为IAA抑制剂)为主要试材,通过烟草表型观察,结果发现在表型上10-4mol/LIAA对harpinxoo在烟草叶片上激发的HR具有一定的抑制作用。分子检测方面,选取真核生物中高度保守并且为组成性表达的基因EF-1α口作为内参基因,通过半定量PCR,检测了植物过敏反应标志基因hsr203J、抗病防卫基因chia5、硝酸还原酶基因nr,以及ChtA、ChtB、GluA、GluB等20多个基因的表达情况。并重点针对hsr203J和chia5做了荧光定量PCR的检测。结果显示:当烟草叶片未经任何实验处理时hsr203J和chia5无表达,nr有表达;104mol/LIAA和500μMTIBA单独作用于烟草叶片后对上述基因的表达均无影响;harpin蛋白激发烟草叶片产生HR,hsr203J和chia5有表达,nr无表达。10-4mol/LIAA与harpin蛋白复合处理使HR作用减弱,但此时基因hsr203J的表达却略有增加,基因chia5的表达明显降低,nr仍无表达。而经500ILMTIBA处理抑制10-4mol/LIAA作用后,被IAA抑制的harpin蛋白激发的HR又能够得以部分恢复,所产生的HR斑大小介于蛋白HR斑和经104mol/LIAA和harpin蛋白复合处理的HR斑大小之间,此时hsr203J、chia5也有表达。只是基因hsr203J的表达较单独harpin蛋白作用产生HR和10-4mol/LIAA与蛋白复合处理都明显降低;基因chia5的表达却是比harpin蛋白激发烟草叶片产生HR的处理低,比经IAA和蛋白互作后表达要高,nr仍无表达。
综合烟草表型实验和分子生物学检测,最后得出结论:生长素在一定程度上可以逆转harpin蛋白在烟草叶片上激发的植物过敏反应。这为进一步更深入研究harpin激发的HR的调控机制奠定了一定的理论基础。