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Raf激酶抑制蛋白(RKIP)是一个保守的,多功能的蛋白,参与对Raf/MAPK,GPCR以及NF-κB信号通路的调节,并与肿瘤等多种生理及病理过程密切相关,但其功能与作用途径尚有待进一步阐明。大量研究证明,RKIP的mRNA水平以及蛋白质水平在多种肿瘤细胞中均出现了下调,这种下调往往伴随着肿瘤恶性程度的增加以及迁移能力的增强,但目前为止其表达量下降的原因仍有待阐明。因此,研究RKIP的转录调控机制具有理论及实践意义。 本室对RKIP转录调控的研究显示,RKIP启动子(-56/+261)片段对维持其转录活性起关键作用。通过生物信息学分析,发现该片段可能包含两个Spl,一个p300以及一个CREB结合序列,同时该片段不包含经典的TATA盒。通过定点突变分析、siRNA干扰、过表达转录因子以及EMSA等方法,证明在人黑色素瘤A375细胞中,RKIP(-5/+5)区域可以被Spl蛋白识别,并上调RKIP转录活性。同样,数据表明p300也可以与RKIP(-108/+121)区域结合并上调其转录活性。此外,还发现CREB与p300之间可能存在协同作用,共同上调RKIP的启动子活性。上述研究为揭示RKIP的转录调控机制提供了新的实验依据。 本室已有工作显示PKC活性与RKIP的mRNA水平呈负相关,提示PKC可能参与对RKIP转录的调控。己知PKC通过磷酸化RKIP蛋白从而调节RKIP在Raf/MEK/ERK及GPCR信号通路间的功能转换。研究提示:PKC可能通过一种新的作用机制参与对RKIP的调控。为了验证PKC是否可以调控RKIP转录,利用PKC的抑制剂Bisindolylmaleimide处理转染有RKIP启动子-193/+261及-56/+261片段的A375黑色素瘤细胞。结果显示,抑制PKC的活性会导致RKIP启动子活性上升。随后将组成型活化以及显性抑制型的PKCα与RKIP启动子(-56/+261)片段共同转染到A375细胞中,结果表明PKCα活性与RKIP启动子活性呈显著负相关,但PKCα通过何种方式参与对RKIP的转录调控尚有待于进一步探讨。 通过对RKIP上游调控序列(-813/+261)的分段研究,发现在RKIP启动子(-600/-343)区域可能存在转录负调控因子的结合位点。为了进一步阐明在恶性肿瘤细胞中RKIP表达下调的分子机制,对该启动子(-600/-343)区域进行了生物信息学分析,发现该区域存在9个候选的转录因子结合元件,利用定点突变的方法,分析了上述元件对RKIP转录活性的影响。但结果显示上述元件被定点突变后并没有对RKIP启动子活性产生明显的影响,提示该区域可能存在其它的转录调控元件,这一工作有待后续的研究证明。 由于RKIP的功能与作用途径仍没有被完全阐明,而寻找RKIP相关的效应分子是揭示RKIP新功能的有效途径,因此,建立了稳定表达RKIP的PC-3M前列腺癌细胞系,并且通过蛋白质组学的方法初步筛选了RKIP作用相关蛋白。初步结果表明脂肪酸结合蛋白(FABP)、细胞色素C氧化酶5A亚基(COX5A)、丝/精氨酸富集剪切因子1(SRSF1)、醛酮变位酶Ⅰ(Glyoxalase-Ⅰ)、核仁磷酸蛋白B23(NPM1)以及癌蛋白D52(TPD52)可能与RKIP的功能密切相关。在此基础上利用RT-PCR方法检测了上述蛋白在mRNA表达水平上的变化。结果表明在RKIP高表达的细胞中TPD52的mRNA含量发生了下调,Glyoxalase-Ⅰ的mRNA含量上升,而对SFSF1的不同转录本ASFA与D的分析发现,ASFA的mRNA水平基本无变化,而ASFD则有轻微上调。这些数据提示RKIP可能通过转录及转录后修饰等途径影响其作用相关蛋白。