背景代谢综合征(MS)是伴有糖尿病／糖耐量异常、高血压、高血脂、中心性肥胖、内皮细胞功能异常等代谢方面异常的一组疾病总称,其发生动脉粥样硬化等心血管并发症的风险明显增加,然而具体机制尚不清楚。研究表明巨噬细胞脂质沉积在代谢综合征患者心血管并发症(包括动脉粥样硬化,高血压和心肌梗塞等)的发生发展中起到了关键作用。巨噬细胞过量的脂质沉积可通过多条信号转导通路启动氧化应激和炎症反应,损伤细胞形态和功能,从而促进心血管并发症的发生发展。因此深入探讨巨噬细胞脂质沉积的分子机制对今后预防代谢综合征心血管并发症的发生具有重要作用。近年来高游离脂肪酸在代谢综合征心血管并发症中的作用正日益引起研究者的关注。临床试验表明在代谢综合征动脉粥样硬化,心肌梗塞等疾病中均存在高血清浓度的游离脂肪酸。尽管高游离脂肪酸所致心血管并发症的发生机制并不清楚,但高游离脂肪酸参与动脉粥样硬化等心血管并发症发生发展的多个环节,如单个核细胞贴壁,血小板聚集,内皮细胞凋亡,胰岛素抵抗,细胞内脂质沉积等,直接损伤心血管功能,促进动脉粥样硬化等心血管并发症的进程。然而高游离脂肪酸能否促进巨噬细胞内脂质沉积进而参与动脉粥样硬化等并发症的发生并不清楚。脂肪酸结合蛋白4(FABP4)作为脂肪酸结合蛋白家族中的一员,特异性表达于巨噬细胞和脂肪细胞中,直接参与脂肪酸的转运和代谢,促进细胞内脂质沉积。近来研究表明,FABP4在连接肥胖和动脉粥样硬化的发生中发挥了重要作用。FABP4表达缺失可通过降低炎症因子在巨噬细胞中的表达保护高血脂老鼠避免动脉粥样硬化的发生。同时在脂肪细胞脂质积聚的过程中FABP4表达增加,然而,FABP4是否参与了高游离脂肪酸所致的巨噬细胞脂质沉积尚不清楚,其中的分子机制也有待于进一步研究。叉头状转录因子01(forkhead transcription factor 01, FOXO1)作为Foxo蛋白家族中的一员,定位于13号染色体并编码655个氨基酸,与细胞周期调控,能量代谢及细胞凋亡有关,近年来其在脂代谢中的作用日益受到关注。FOXO1可被高游离脂肪酸激活,参与细胞内脂质沉积。同时参与脂蛋白脂肪酶(LPL)等多种脂代谢关键酶的转录调节。但是,FOXO1是否参与FABP4的转录调节尚不清楚,同时游离脂肪酸对FOXO1转录活性的调节机制有待进一步研究。因此,基于以上研究,本研究将验证以下假说：高浓度游离脂肪酸通过转录因子FOXO1促进FABP4的表达增加脂肪酸的转运,从而促进细胞内脂质沉积。高浓度游离脂肪酸-FOXO1-FABP4信号通路可能是高游离脂肪酸下诱导巨噬细胞内脂质沉积的新的分子机制,从而为代谢综合征心血管并发症的干预治疗提供潜在靶点。方法1.细胞培养：人单核细胞株THP-1生长于含10%胎牛血清,100U／ml青霉素,100ug/ml链霉素和5%L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养液中。每48-72小时传代一次。取对数生长期细胞进行实验。实验前采用100nm佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)孵育THP-1细胞72小时,使其诱导分化为巨噬细胞。诱导后的细胞予不同浓度的游离脂肪酸处理或转染siRNAs, DNAs以构建细胞模型。2.游离脂肪酸配制：饱和脂肪酸PA,多不饱和脂肪酸LA及单不饱和脂肪酸0A用于本研究中。首先将游离脂肪酸溶解于100%异丙醇配成200mM FFA储存液。后以10%无游离脂肪酸,低内毒性的BSA使其终浓度变为0.25-2mM。调PH至7.5滤器滤过后存于-20℃冰箱备用。3.siRNA及质粒DNA转染：采用特异的siRNA进行基因沉默,包括FOXO1 siRNA。并采用质粒DNA转染进行过表达,包括野生型FOXO1 (WT),负显性型FOXO1 (DN)及持续激活型FOXO1 (CA).使用lipofectamineTM 2000脂质体包裹并转染THP-1巨噬细胞。被转染的巨噬细胞,再予以游离脂肪酸处理。4. Western Blot:处理后的细胞采用细胞裂解液提取总蛋白。取15μg蛋白与蛋白Marker一起上样。在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳后,转移至聚偏氟乙烯膜(PVDF)上。电转膜采用牛奶封闭,一抗孵育过夜,PBST清洗三遍后,使用HRP标记的二抗孵育。ECL曝光显色。蛋白半定量采用Quantity One软件进行,以目的蛋白与β-actin条带积分光密度的比值表示蛋白表达的相对值。5.实时定量PCR：采用Trizol提取细胞的总RNA。mRNA应用iScript cDNA合成试剂盒逆转录成cDNA。iCycler iQ荧光探针系统进行实时PCR。采用FABP4与β-actin循环阈值(threshold cycle, Ct)的比值表示mRNA的相对水平。6.细胞内脂质沉积的检测：应用油红0染色检测细胞内脂质沉积。处理后的细胞以福尔马林固定,然后在油红0工作液中孵育30分钟,测定490nm的吸收光值。7.免疫荧光染色：载玻片上处理的细胞使用含有1%BSA的一抗进行孵育,清洗后用得克萨斯红标记的二抗进行处理。DAPI染核,封片后采用Olympus Fluoview 300荧光显微镜采集图像。结果1.高浓度游离脂肪酸增加巨噬细胞内脂质沉积应用不同浓度的游离脂肪酸处理巨噬细胞以构建细胞模型。结果发现游离脂肪酸可显著增加细胞内脂质沉积,并呈剂量依赖性(P<0.05)。2.高游离脂肪酸通过调节脂肪代谢基因表达增加脂质沉积游离脂肪酸可促进FABP4和DGAT的表达,而抑制CPT-1的表达,提示游离脂肪酸可能通过增加脂肪酸转运,抑制脂肪酸氧化,增加甘油三脂合成而增加巨噬细胞内脂质沉积。3.高浓度游离脂肪酸在转录水平调节FABP4的表达采用实时定量PCR发现,PA能显著增加FABP4的mRNA水平并呈剂量依赖性,表明游离脂肪酸能在转录水平增加FABP4的表达。4.转录因子FOXO1参与了PA所致的FABP4的表达增加我们进一步研究FOXO1是否介导PA所致的FABP4表达增加。采用特异性siRNA沉默FOXO1基因(P<0.01), FOXO1 siRNA可逆转棕榈酸所致的FABP4的上调。同时过表达野生型和持续活性型FOXO1能显著增加FABP4的表达而负显性型FOXO1降低FABP4的表达,以上结果表明FOXO1正性调节FABP4的表达。5. FOXO1参与了PA所致的巨噬细胞内脂质沉积FOXO1siRNA不仅降低基础状态下巨噬细胞内脂质沉积,也可逆转游离脂肪酸诱导的细胞内脂质沉积的增加,表明FOXO1参与了PA所致的巨噬细胞内脂质沉积。6.PA可通过促进FOXO1核转位激活FOXO1介导的转录活性免疫荧光显示,棕榈酸能促进FOXO1的核转位,提示PA能通过促进FOXO1核转位激活其转录活性而增加FABP4的转录水平。结论1.高浓度游离脂肪酸通过增加FABP4和DGAT的表达,降低CPT-1的表达而增加巨噬细胞脂质沉积,并呈剂量依赖性。2.棕榈酸在转录水平调节FABP4的表达,转录因子FOXO1参与该过程的调节。3.棕榈酸通过促进FOXO1核移位增加其转录活性。4.转录因子FOXO1参与游离脂肪酸所致的巨噬细胞脂质沉积5. FFA-FOXO1-FABP4信号通路可能是高游离脂肪酸下诱导巨噬细胞内脂质沉积的新的分子机制,为代谢综合征心血管并发症的干预治疗提供了理论基础。背景游离脂肪酸介导的脂质沉积在代谢综合征心血管并发症的发生发展中起关键作用。巨噬细胞脂质沉积可加剧血管壁胆固醇和甘油三脂的沉积,或增加心血管氧化应激和炎症反应引起组织损伤和细胞功能异常。因此有效减少细胞内脂质沉积对预防代谢综合征心血管并发症的发生具有重要作用。AMPK可启动分解代谢途径从而增加ATP的产生,因此在能量代谢调控中发挥重要作用。目前研究证实AMPK信号通路的激活具有心血管保护效应。但机制不明。以往研究表明二甲双胍可激活AMPK通路。同时AMPK的激活可有效降低肝脏,骨骼肌,脂肪等细胞内的脂质沉积。但是,AMPK通路的激活能否降低棕榈酸(palmitic acid, PA)所致的巨噬细胞内脂质沉积尚不明确,其中的机制尚不清楚。脂肪酸结合蛋白4 (FABP4)作为脂肪酸结合蛋白家族中一员,参与了细胞内脂肪的转运和脂肪酸代谢,可促进细胞内脂质的沉积。许多研究表明,FABP4在肥胖和动脉粥样硬化中表达增强,FABP4表达缺失能保护高血脂老鼠避免动脉粥样硬化的发生发展,提示FABP4是连接肥胖和动脉粥样硬化的重要分子。然而,FABP4是否参与AMPK通路对细胞内脂质沉积的调节以及AMPK通路如何调节FABP4的表达,均需要进一步的验证。最近研究发现转录因子FOXO1是调节脂肪代谢的关键转录因子。FOXO1可促进细胞内的脂质沉积,同时参与多种脂肪代谢相关酶的转录调节,促进脂肪酸转运及甘油三脂合成。本研究前期研究发现FOXO1参与了FABP4的转录调节,但AMPK通路对FOXO1的转录活性以及FABP4表达的影响尚不明确。因此,本研究将验证如下假说：AMPK通路的激活能够通过降低游离脂肪酸所致的FABP4的表达而降低细胞内脂质沉积。FOXO1作为转录因子参与了该过程的调控。AMPK-FOXO1信号通路可能是减少巨噬细胞内脂质沉积的重要防御机制,从而为治疗代谢综合征心血管并发症提供潜在治疗靶点。方法1.细胞培养：原代人单个核细胞系THP-1 (human monocytic leukemia cell line THP-1),生长于含10%胎牛血清,100U／ml青霉素,100ug/ml链霉素和5%L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中。取对数生长期细胞进行实验。实验前采用100nM佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)孵育THP-1细胞72小时,使其诱导分化为巨噬细胞后,细胞被转染siRNAs,质粒DNA或刺激以不同浓度的二甲双胍或者PA以构建细胞模型。2.游离脂肪酸的配制：将棕榈酸(PA)溶解于200mM的异丙醇中,同时以10%无游离脂肪酸,低内毒素的BSA使其终浓度在1-5 mM。所有溶液的PH值调为7.5,使用滤器过滤,-20℃储存。将不含有PA的BSA溶液作为对照。在处理细胞前将PA按1：10的比例使用1640培养基进行稀释。3.siRNA及质粒DNA转染：采用特异siRNA进行基因沉默,包括AMPK siRNA和FOXO1 siRNA。质粒DNA转染分别用0.5μg野生型FOXO1表达质粒(FOXO1 WT),负显性型FOXOl表达质粒(dominant-negative FOXO1, DN)和持续激活型FOXO1表达质粒(constitutively active-FOXO1, CA)处理THP-1巨噬细胞。采用lipofectamineTM 2000脂质体包裹,并转染巨噬细胞。被转染的THP-1巨噬细胞,再使用PA和met等处理24h。4.免疫荧光染色：将处理好的细胞使用含有一抗1%BSA进行孵育,并用得克萨斯红标记的二抗进行孵育。使用DAPI染核,采用Fluoview 300 Olympus荧光显微镜采集图像。5. Western Blot:处理后的细胞使用细胞裂解液提取细胞总蛋白。将含有15μg蛋白的样本和蛋白Marker一起上样。在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳,再用电转仪电转染到聚偏氟乙烯膜(PVDF)上。电转膜封闭后,一抗孵育过夜,清洗后,再使用HRP标记的二抗孵育。滴加ECL显色。蛋白强弱采用目的蛋白和(3-actin积分光密度的比值表示。7.实时定量PCR：处理后的细胞采用Trizol提取细胞总RNA。应用iScript cDNA合成酶将mRNA逆转录成cDNA。后采用iCycler iQ荧光探针系统进行实时PCR。采用FABP4与P-actin的循环阈值(threshold cycle, Ct)的比值并通过公式2ΔCt (ΔCt=β-actin Ct-target gene Ct)表示mRNA的相对水平。8.细胞内脂质沉积检测：采用油红0染色检测细胞内脂质沉积。4%福尔马林固定后在油红0工作液中染色30分钟,测定490nm下的吸收光密度值。结果1. AMPK降低PA所致的巨噬细胞内脂质沉积：PA能显著增加巨噬细胞内脂质沉积。二甲双胍所致的AMPK激活可降低PA所致的的巨噬细胞内脂质沉积,同时采用特异小分子干扰RNA (siRNA)来抑制AMPK表达不仅增加基础状态下巨噬细胞内脂质沉积,同时增加PA所致细胞内脂质沉积。二甲双胍诱导的脂质沉积的减少可由AMPK SiRNA所阻断。2. AMPK降低FABP4的表达：二甲双胍引起的AMPK激活无论是在PA存在还是不存在的情况下均可显著抑制FABP4的表达。用特异siRNA敲除AMPK可增加基础状态FABP4的表达并逆转二甲双胍引起的FABP4的表达降低。同时野生型AMPK质粒能显著降低FABP4的表达而负显性AMPK能增加FABP4的表达,表明AMPK通路激活可下调FABP4的表达。3. AMPK在转录水平调节FABP4的表达：通过实时定量PCR,发现PA显著增加FABP4mRNA。二甲双胍引起的AMPK激活能显著降低FABP4 mRNA表达并呈剂量依赖性。特异性siRNA敲除AMPK可增加基础FABP4表达。同时逆转二甲双胍所致的FABP4 mRNA水平下降,表明AMPK在转录水平调节FABP4的表达。4.FOXO1正向调节FABP4的表达：为进一步探究AMPK如何下调FABP4 mRNA,我们研究FABP4的转录调节机制,验证FOXO1是否调节FABP4的表达。结果显示野生型FOXO1和持续活性型FOXO1能增加FABP4的表达,而负显形型FOXO1显著降低FABP4的表达,无论是在PA存在还是不存在的情况下,提示FOXO1可以正向调节FABP4的表达。同时特异性siRNA敲除FOXO1降低基础状态下和PA诱导的FABP4的表达,表明FOXO1参与了PA诱导的FABP4的表达上调。6. AMPK通过促进FOXO1核外排降低FABP4的表达：我们进一步研究AMPK通路激活是否通过调节FOXO1下调FABP4的表达。二甲双胍能逆转野生型FOXO1和持续活性型FOXO1引起的FABP4的上调,表明AMPK通过抑制FOXO1下调FABP4的表达。免疫荧光显示PA显著增加FOXO1的核积聚同时AMPK激活不仅可使FOXO1保持在胞浆同时能有效抑制FOXO1的核积聚。AMPK siRNA可逆转PA诱导的FOXO1核积聚,降低二甲双胍诱导的FOXO1核外排。以上研究表明AMPK通过促进FOXO1核外排抑制其转录活性,进而降低FABP4的表达。结论1.AMPK激活可通过下调FABP4表达显著降低PA所致的细胞内脂质沉积2.转录因子FOXO1正向调节FABP4的表达。3. AMPK通过促进FOXO1核外排,降低其转录活性而抑制FABP4的转录。4. AMPK-FOXO1信号通路对高游离脂肪酸所致的细胞内脂质沉积有保护作用,是治疗代谢综合征心血管并发症的潜在治疗靶点。