研究背景：骨肉瘤是人类最常见的恶性骨肿瘤,好发于青少年,恶性程度高,易发生早期转移,有较高的致死和致残率。目前对于骨肉瘤的治疗一般采取化疗联合手术切除的综合疗法,但是随着治疗时间的增加,多药耐药骨肉瘤细胞的出现极大的影响了新辅助化疗的效果,使骨肉瘤患者的5年生存率徘徊在58%-70%左右,很难再进一步提高,成为骨肉瘤治疗过程中的主要的障碍和难题。所以研究骨肉瘤多药耐药的发生机制,寻找逆转耐药的方法成为目前骨肉瘤治疗过程中急需解决的问题。研究骨肉瘤多药耐药的机制首先要在体内外建立骨肉瘤多药耐药的模型。耐药模型的建立的方法一般有两种：成熟细胞系诱导或者耐药骨肉瘤细胞原代培养。其中前者更具有稳定性、代表性和说服力U2OS是研究常用的人骨肉瘤细胞系,但由于其体内致瘤率低而不利于体内实验的进行,因此我们还选取了具有较高致瘤性的MNNG/HOS人骨肉瘤细胞系,通过化疗药物诱导建立此三种细胞系的骨肉瘤多药耐药细胞模型,这在国内外尚属首例。骨肉瘤干细胞是骨肉瘤中一小群具有自我更新和分化功能的细胞。通常这部分细胞处于静止期,当受到刺激或者周围微环境改变时,它就会不断增殖分化成异质性的肿瘤细胞。骨肉瘤干细胞具有无限增殖、多药耐药和高致瘤性等特点,常规治疗方法很难将其杀灭,所以它们被看做是骨肉瘤耐药、复发和转移的罪魁祸首。研究表明,骨肉瘤干细胞可表达特殊的表面标志,例如CD133、CD105和Stro-1等。目前对于骨肉瘤干细胞的表面标记的研究尚处于起步阶段,存在较多的争论,但是比较公认的观点是根据细胞表面标志不同而分离出的干细胞均处于决定肿瘤细胞分化方向的重要阶段,它们对肿瘤的生长、侵袭、耐药、复发起着决定作用。因此进一步研究和发现骨肉瘤干细胞的表面标志,对于研究肿瘤干细胞的形成机制和耐药机制具有重大意义。低亲和力神经生长因子受体CD271,是骨髓间充质干细胞的表面标记,近来研究发现它也是黑色素瘤和乳腺癌的干细胞标记,而骨肉瘤干细胞与CD271的关系目前国内外尚未见研究报道。肿瘤多药耐药机制复杂多样,与ABC转运蛋白、TOPOⅡ癌基因Bcl-2、P53、NF-κB等因素有关。其中MDR1(P-gp)被认为足包括骨肉瘤在内多种肿瘤发生多药耐药的主要原因,它能将化疗药物逆浓度梯度排出在细胞外,从而增加肿瘤细胞对化疗药物的耐受性。研究骨肉瘤耐药细胞系肿瘤干细胞中MDR1(P-gp)的表达和功能有助于阐明骨肉瘤的耐药机制,为寻找逆转耐药提供新方法。逆转肿瘤多药耐药是所有耐药研究的根本目的,逆转骨肉瘤多药耐药也是目前研究的热点。逆转骨肉瘤多药耐药的方法包括化学药物和中药制剂逆转、免疫抗体逆转、基因扰逆转等。由于中药活性成分逆转作用可靠,毒副作用小,易于获得,因此中药活性成分对于骨肉瘤耐药逆转的作用及机制成为研究的热点姜黄素有几百年的应用历史,具有有广泛的抗肿瘤活性,在体外能够逆转L1210/Adr、SGC7901/VCR、KB-V1和U2OS/AMD等肿瘤细胞的多药耐药性。因此研究姜黄素逆转骨肉瘤细胞多药耐药的作用及其机制,可为骨肉瘤的治疗寻僻新的途径。第一部分：人类骨肉瘤多药耐药细胞系SaOS-2/MTX, U20S/MTX和MNNG/HOS/MTX的建立与验证目的：1.诱导人类骨肉瘤耐药细胞系SaOS-2/MTX, U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX;2.验证SaOS-2/MTX, U2OS/MTX和MNNG/MOS/MTX的多药耐药性,形成稳定的人类骨肉瘤多药耐药细胞系,为后续研究骨肉瘤多药耐药机制奠定基础。方法：1.以甲氨蝶呤(Amethopterin, MTX)为诱导剂,采用化疗药物冲击并且逐步增加药物浓度的方法,诱导人类骨肉瘤细胞系(SaOS-2, U2OS和MNNG/HOS),并建立耐甲氨喋呤的人骨肉瘤细胞系(SaOS-2/MTX, U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX);2.利用光学显微镜观察细胞一般形态的变化,以培养天数为横轴、细胞数量为纵轴绘制生长曲线,比较耐药细胞系与其母代细胞系在形态和增殖能力上的变化；3. MTT法分别检测耐药细胞株(SaOS-2/MTX, U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX)对MTX、阿霉素(Doxorubicin, ADM)、表柔比星(Epirubicine, EPI)、(?)顺铂(Cisplatin, DDP)和异环磷酰胺(Ifosfamide, IFO)的药物敏感性：计算其半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)和耐药指数(resistance index, RI),观察各耐药细胞系对骨肉瘤常见化疗药物的耐药性；4.利用Real-time PCR和Western blot技术分析骨肉瘤细胞耐药前后MDR1基因表达的变化。结果：1.经过6个月的诱导,建立人骨肉瘤耐MTX细胞系(SaOS-2/MTX, U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX),耐药细胞系能在含有2000ng/mlMTX的培养液中稳定生长、增殖、传代：2..显微镜下观察SaOS-2/MTX, U20S/MTX和MNNG/HOS/MTX细胞,细胞系表现出与母代细胞系相似的特征,但部分细胞体积增人,多形细胞、多核和巨核细胞增多；细胞生长曲线显示耐药细胞系生长曲线较母代细胞系平缓,增殖速度减慢；3.MTT法检测结果表明,耐药细胞针对各化疗药物的IC50(SaOS-2/MTX, U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX)值与非耐药细胞IC50(SaOS-2, U2OS和MNNG/HOS)相比在统计学上均有显著差异(P<0.05)。观察各药物耐药指数,SaOS-2/MTX对MTX为高度耐药,对ADM、EPI为中度耐药,对DDP、IFO为轻度耐药；U20S/MTX和MNNG/HOS/MTX对MTX和ADM为中度耐药,对EPI、DDP和IFO为低度耐药；4. Real-time PCR和Western blot结果显示耐药细胞系(SaOS-2/MTX, U20S/MTX和MNNG/HOS/MTX)中多药耐药基因(Multiple drug resistance1, MDR1)的农达比非耐药细胞明显增多(P<0.05)。结论：1.通过MTX冲击诱导的人类骨肉瘤耐药细胞系(SaOS-2/MTX, U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX)具有多药耐药的特性,对MTX、ADM、 EPI、DDP、IFO均有不同程度耐药,并能稳定培养传代能够满足后续试验需要：2.耐药细胞系从本保持了与母代细胞系相似的特性,但是部分细胞形态略有改变,增殖变慢;3.骨肉瘤的多药耐药与MDR1(?)的表达有密切的关系,MDR1过表达可能是骨肉瘤多药耐药的主要原因之一。第二部分：CD133+或CD271+骨肉瘤细胞介导骨肉瘤多药耐药的体内外相关研究目的：1.鉴定骨肉瘤多药耐药席细胞系(SaOS-2/MTX, U20S/MTX, MNNG/HOS/MTX)中肿瘤干细胞的存在；2.分析验证CD133或CD271与骨肉瘤干细胞之间的关系：3.比较研究骨头瘤耐药细胞系和非耐药细胞系中干细胞的变化,探讨骨肉瘤干细胞在骨肉瘤多药耐药中的作用和机制。方法：1.利用免疫组化技术研究骨肉瘤患者临床病理标本中CD271的表达情况;2.用骨肉瘤耐药细胞系(SaOS-2/MTX、U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX)和非耐药细胞系(SaOS-2、U2OS和MNNG/HOS)制备细胞爬片,进行CD271的免疫组化染色,比较观察二者之间CD271的表达变化;3.流式细胞仪检测骨肉瘤细胞系SaOS-2、U2OS、HOS、SaOS-2/MTX、U20S/MTX和MNNG/HOS/MTX中CD133或CD271的表达比率,分析细胞耐药前后CD133或CD271表达变化；4.磁珠分选技术分别分选SaOS-2/MTX、U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX中CD133或CD271阳性的细胞；5.将各耐药细胞系CD133阴性/阳性、CD271阴性/阳性细胞分别种入低吸附六孔板中进行无血清培养,观察细胞的单克隆成球率；6. Real-time PCR和Western blot分别检测耐药细胞系中CD133阴性/阳性、CD271阴性/阳性细胞中MDR1、Nanog和OCT4基因的的表达差异；7.体内实验检测骨肉瘤干细胞致瘤性：将各骨肉瘤耐药细胞系中CD133阴性/阳性、CD271阴性/阳性细胞分别植入4周大小BALB/c裸鼠中(每组5只,共30只),观察裸鼠的成瘤率。结果：1.不同类型的骨肉瘤标本中均有不同程度的CD271阳性细胞表达;2.细胞免疫组化结果显示CD271在六种骨肉瘤细胞系中均有不同程度表达,其中耐药细胞系(SaOS-2/MTX、U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX)中的表达高于非耐药细胞系(SaOS-2、U2OS和MNNG/HOS)(P<0.05);3.流式细胞仪分析显示耐药细胞系中CD133或CD271的表达比例明显高于非耐药细胞系,其中CD133和CD271的表达趋势相似；4.磁珠分选成功从耐药细胞系SaOS-2/MTX、U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX中分选出CD133阳性和CD271阳性细胞,无血清培养结果显示CD133阳性或CD271阳性细胞的成球率显著高于阴性细胞；5. Real-time PCR和Western blot检测发现MDR、Nanog和OCT4基因在CD133阳性和CD271阳性细胞中显著表达(P<0.05);6.体内实验显示,U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX中CD133或CD271阳性的细胞在裸鼠体内种植成瘤的几率要明显高于CD133或CD271阴性细胞,而SaOS-2/MTX细胞在裸鼠体内未发现有种植瘤生长的情况。结论：1.CD271阳性细胞在骨肉瘤标本和细胞系中存在,其表达比例较CD133略、高；2.CD133或CD271阳性骨肉瘤细胞能在无血清培养基中成球,在裸鼠体内致瘤,具有干细胞的某些特性,CD271可能是骨肉瘤干细胞的一个新的表面标记：3.耐药细胞系SaOS-2/MTX、U20S/MTX和MNNG/HOS/MTX中肿瘤干细胞(CD133或CD271阳性)的比例增加,干细胞特政性基因(Nanog或OCT4)的表达也明显升高,说明骨肉瘤干细胞参与了骨肉瘤多药耐药过程,并在其中可能发挥主要作用；4.骨肉瘤多药耐药的主要机制可能是骨肉瘤干细胞过表达MDR1(P-gp)引起的多化疗药物耐受。第三部分：姜黄素逆转骨肉瘤干细胞多药耐药的体内外相关研究目的：1.体外实验观察姜黄逆转人骨肉瘤煳SaOS-2/MTX, U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX细胞多药耐药的作用;2.体内实验观察姜黄素逆转MNNG/HOS/MTX(?)细胞系耐药,增敏化疗药物的作用；3.探讨姜黄素逆转肉瘤多药耐药的相关作用机制;4.观察在多药耐药逆转过程中骨肉瘤干细胞的变化,进一步分析肉瘤多药耐药的根本机制和逆转方法。方法：1.铜过MTT法检测姜黄素对骨肉瘤耐药细胞系(SaOS-2/MTX,U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX)的影响;2.选取30μM浓度的姜黄素进行逆转骨肉瘤耐药细胞系多药耐药的体外实验,观察其逆转效果；3.流式细胞仪检测姜黄素联合MTX作用前后,骨肉瘤耐药细胞系(SaOS-2/MTX、U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX)’中肿瘤干细胞(CD133或CD271阳性)比例的变化；4.将SaOS-2/MTX, U20S/MTX和MNNG/HOS/MTX分别经过0、10、20、30、40μM的姜黄素刺激后,通过Real-time PCR和Western blot检测MDR1基因表达的变化；5.共聚焦显微镜和流式细胞仪检测姜黄素对SaOS-2/MTX, U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX细胞内罗丹明123(Rhodamine123, Rh123)积聚和外排的影响。6.体内实验：磁珠分选MNNG/HOS/MTX中CD133或CD271阳性细胞接种于20只BALB/c裸鼠中,一周后应用MTX (MTX组)或姜黄素联合MTX (Cur/MTX)进行干预,4周后处死老鼠观察成瘤率、肿瘤体积大小,对种植瘤进行病理学检查,并检测种各组种植瘤中Nanog、OCT4和MDR1基因的表达变化。结果：1.30μM浓度以下的姜黄素对骨肉瘤多药耐药细胞影响较小；2.通过MTT法计算各化疗药物的IC50和RI显示30μM姜黄素能不同程度逆转SaOS-2/MTX, U20S/MTX和MNNG/HOS/MTX对各化疗药物的耐药性；3.姜黄素联合MTX作用于耐药细胞,能够增敏化疗药物并杀伤骨肉瘤耐药细胞系中的干细胞,降低其比例；4、Real-time PCR和Western blot结果显示,姜黄素能浓度依赖性的下调耐药细胞株SaOS-2/MTX, U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX中MDR1的表达；5.共聚焦显微镜和流式细胞仪检测显示姜黄素能增加Rh123在SaOS-2/MTX, U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX细胞内的聚集,抑制Rh123的外排,且呈浓度依赖关系；6.体内试验显示,姜黄索能在体内增加MTX的敏感性,降低肿瘤干细胞的成瘤率和下调Nanog、OCT4和MDR1基因的表达。结论：1.姜黄素在体外可有效逆转骨肉瘤耐药细胞系SaOS-2/MTX, U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX的多药耐药现象；2.姜黄素在体内外能增敏化疗药物,杀伤骨肉瘤干细胞,降低骨肉瘤侵袭、转移和耐药的能力；3.姜黄素逆转骨肉瘤多药耐药的机制可能是下调骨肉瘤干细胞中MDR1基因表达,并且同时抑制其细胞膜上P-gp的转运功能；4.姜黄素逆转耐药试验证明骨肉瘤干细胞(CD133或CD271阳性)的耐药性是骨肉瘤产生多药耐药的主要原因,姜黄素是骨肉瘤多药耐药性的良好逆转剂。