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伪狂犬病（Pseudorabies,PR）、猪瘟（Classical swine fever,CSF）和猪圆环病毒病（Porcine circovirus associated disease,PCVAD）在全世界范围广泛分布，三者常常混合感染，对养猪业造成巨大的经济损失。CSF是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的，而E2蛋白作为猪瘟病毒的囊膜糖蛋白，常用于猪瘟亚单位疫苗的研制。猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2,PCV-2）感染所致，病毒衣壳蛋白（Capsid,Cap）是猪圆环病毒病亚单位疫苗开发的主要抗原蛋白。2011年，Bartha-K61疫苗免疫的猪场爆发伪狂犬病；前期研究表明，用新分离的PRV变异株PRV TJ攻毒时，Bartha-K61疫苗无法对猪只提供完全的保护；而gE/gI/TK基因缺失PRV TJ疫苗安全性能高，能够提供完全保护。多价疫苗，尤其是表达外源蛋白的病毒载体疫苗，是抵抗多种猪病混合感染的有效策略。因此，基因缺失PRV开发多价活病毒载体疫苗具有良好的应用前景。在本研究中，利用Fosmid文库平台构建了共表达CSFV E2蛋白和PCV2Cap蛋白的gE/gI/TK三基因缺失重组PRV，利用间接免疫荧光技术（IFA）和免疫印迹法（WB）验证E2蛋白和Cap蛋白可在PK-15细胞上高水平表达。重组病毒rPRVTJ-delgE/gI/TK-E2-Cap在pK-15细胞上传代20代后，其生长曲线与亲本病毒rPRV-delgE/gI/TK无明显差别，说明基因缺失和外源基因的插入不影响PRV病毒粒子的形成和增殖能力。以P5、P10、P15和P20代病毒的基因组为模板，PCR扩增均能获得比亲本毒对应基因分子量减小的gE/gI/TK基因以及外源基因E2和Cap，说明该重组病毒具有良好的遗传稳定性。在家兔和猪只上的免疫评价结果表明，rPRVTJ-delgE/gI/TK-E2-Cap对家兔和猪是安全的，没有引起任何PRV特异性的临床症状，包括发热。从免疫后家兔和猪只的血清中均能检测出抗PRV的抗体，但没有抗CSFV和PCV2的抗体，可能插入外源基因的条件不合适或E2和Cap蛋白的表达量太低不足以诱导产生抗体。本研究为病毒载体疫苗的开发提供了一个新的平台，并为优化设计后的rPRVTJ-delgE/gI/TK-E2-Cap有希望作为一种的三价候选疫苗，以对抗PRV、PCV2和CSFV混合感染提供了新的见解。