论文部分内容阅读
糖类化合物不仅为植物的生长发育提供能量来源,同时还可作为底物用于多种物质的合成代谢。近年来的研究发现,糖还是一种重要的信号分子调控植物的多个生长和发育过程。植物体内糖信号调控机制复杂,生长发育状态、昼夜节律和生物/非生物胁迫等因素会引起糖浓度变化从而影响糖信号转导过程。糖信号对于维持植物正常的生长发育、成熟和衰老过程都具有重要意义。糖信号尤其是葡萄糖信号能够诱导糖酵解、花青素和淀粉贮存等相关基因的表达,而抑制光合作用相关基因的表达,但对于植物如何在短时间内快速响应糖信号影响基因表达的分子调节机制尚不清楚。本研究通过对模式植物拟南芥葡萄糖信号快速诱导基因GPT2(Glucose-6-phosphate/phosphatetranslocator2)的表达调控模式进行深入研究,发现该基因上游调控区包含有关键的糖响应位点W-Box元件以及组蛋白乙酰化修饰区域。GPT2基因编码一种定位于质体内膜上的转运蛋白,可以通过在细胞质和质体间转运G6P参与细胞分裂分化过程、种子成熟与萌发过程以及植物适应光强变化时的物质转运过程。通过利用分子生物学、生物化学、遗传学等方法,鉴定出参与介导糖信号快速响应过程的正向调控蛋白WRKY18、WRKY53和HAC1,并分析其在糖信号通路中的作用机制。主要研究结果如下:(1)通过转录组比对和RT-qPCR分析发现,GPT2基因在短时间内对外源葡萄糖处理响应最明显,可以选择作为研究糖信号快速响应的Marker基因。进一步,将GPT2基因启动子与报告基因GUS和LUC分别连接构建糖响应报告系统,通过顺式作用元件分析、点突变分析和实时荧光报告系统等方法确定GPT2启动子区所包含的W-Box元件是植物快速响应葡萄糖信号的关键顺式调控元件;(2)利用GPT2pro-P3::LacZ作为诱饵载体,使用酵母单杂交系统鉴定到多个WRKY类转录因子可以在体外结合GPT2的启动子,进一步通过RT-qPCR、转录激活实验、生物荧光分析以及遗传学实验确定WRKY18和WRKY53在糖信号快速响应过程中发挥积极作用;(3)高浓度葡萄糖处理拟南芥,在wrky18、wrky53以及wrky18 wrky53突变体中葡萄糖诱导的花青素积累受抑制,表明WRKY18、WRKY53不仅在植物短时间糖信号快速响应过程起作用,在长时间的糖处理过程中也扮演重要角色。进一步,使用ChIP-qPCR实验证明了当胞内糖浓度升高时,WRKY18和WRKY53可以直接结合在GPT2,CHS和DFR等糖诱导基因的启动子上并激活其表达,;(4)使用酵母双杂交系统筛选到乙酰转移酶HAC1与WRKY18和WRKY53之间存在直接的蛋白间相互作用,并进一步通过BiFC、LCI和Co-IP等实验手段进行了证实,证明HAC1可以与WRKY18,WRKY53在植物体内直接互作;(5)经表型观察及RT-qPCR实验分析,确定hac1-4突变体表现糖响应缺失表型,即花青素含量降低,糖诱导基因表达受到抑制等;(6)为明确WRKY18,WRKY53和HAC1在糖信号转导过程中的作用,对w18 w53,hac1-4突变体经低浓度的葡萄糖短时间处理后进行转录组测序,分析发现WRKY18-WRKY53-HAC1共同激活多个糖诱导基因的表达,参与调控包括淀粉合成,花青素积累等在内的多个生理途径,这与表型观察结果一致;(7)因为HAC1在糖响应过程中的正向调控作用,首先使用Western Blot和ChIP-qPCR实验证实糖信号在激活基因表达的过程依赖组蛋白乙酰化修饰,特别是H3K27ac水平升高,进一步使用ChIP-qPCR实验发现在hac1-4突变体中糖诱导基因启动子区H3K27ac富集水平受抑制;通过转录激活实验证实HAC1与WRKY18,WRKY53对下游基因的激活依赖彼此的功能,表明HAC1,WRKY18,WRKY53协同调控植物糖信号快速响应过程。综上所述,本研究将糖信号、WRKY转录因子以及HAC1蛋白有机联系在一起,揭示了组蛋白乙酰化修饰和WRKY转录因子在糖信号通路中对植物生长、代谢的作用,为明确植物中糖分的运输、存储和利用情况,进一步提高作物产量、改善果蔬品质提供理论依据。