研究背景和目的： 系统性硬皮病(systemicscleroderma，SSc)是一种以局限性或弥漫性皮肤及内脏器官的纤维化为特征的结缔组织病。目前其确切病因及发病机制仍未明确，亦无切实有效的治疗手段，探讨本病的发病机理，寻找有效的治疗药物和方法有非常重要的意义。 SSc是一种自身免疫性疾病，以皮肤和组织器官纤维化、硬化为特征，其在早期病变时，患者已有显著的细胞免疫和体液免疫异常：包括T淋巴细胞亚群的分布异常，局部单核细胞浸润，多种自身抗体的产生等。而胶原合成过多，分解减少，大量胶原纤维在皮肤、肺、肾、消化道等组织器官的沉积是其主要病理过程之一。人体合成胶原的最主要场所是成纤维细胞，有研究显示，体外培养的SSc病人成纤维细胞合成I、III型胶原纤维的量明显增加；SSc患者成纤维细胞电镜超微结构存在异常，被认为是研究SSc细胞外基质、胶原形成机制的良好体外模型。此外，国内外研究显示，多种细胞因子参与了胶原成分表达的调节，其中转化生长因子-β1(transforminggrowthfacto-beta，TGF-β)在组织纤维化产生的病理机制中起到最为重要的作用。此外，血管病变和遗传、环境因素也被认为参与了SSc的发病机制。 干细胞是具有很强自身增殖能力及向各种类型细胞分化能力的始祖细胞。 近年，间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)由于具备较高的增殖能力、免疫调节活性和低免疫原性而备受关注，为治疗多种疾病提供了新的线索，并且避免了胚胎干细胞研究的伦理学问题，临床应用优势突出。MSC具有以下的生物学特性：1、潜在的抗增殖作用和免疫调节活性。体外研究发现，由同种异体刺激引起的混合淋巴细胞增殖反应体系中加入MSC，几乎使T细胞增殖被完全抑制。在小鼠模型，MSC通过阻断抗原激活的T细胞进入细胞周期的S期而抑制T细胞的分化；在体外，MSC亦有抑制B细胞增殖的作用，尤其在B细胞与MSC的比例为1:1时，这种作用表现得最强；除了对T、B细胞的抑制作用外，MSC也可抑制单核细胞分化成树突样细胞(dendriticcells，DCs)。MSC的免疫调节活性存在剂量依赖性，非MHC限制性，免疫调节的可逆性等特点；2、多向分化潜能，促进组织的修复。大量的实验研究表明，MSC在适宜微环境下可分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、心肌、上皮细胞等，并且MSC能逃避免疫监视，在同种异基因、异种异基因或同种同基因的环境中长期存活，在移植后仍能保持它的多向分化潜能，从而成为组织工程学的重要种子细胞；3、多器官归巢能力和可塑性。4、促进造血植入。目前已在骨髓、肝、脾、肺、肌肉、脑、真皮组织中证实有MSC的存在，而皮肤作为人体最大的组织器官，可提供大量的种子细胞，且取材方便，故选择真皮MSC作为研究的种子细胞具有更广阔的应用前景。 以往针对SSc免疫系统紊乱和纤维化病变的治疗主要集中在免疫抑制剂和抗纤维化药物如D-青霉胺，秋水仙碱等，但副作用大且收效甚微。随着干细胞研究的深入，其在治疗其他医学顽症上取得了斐然的成绩。大量的动物研究发现MSC局部输注或系统输注均可通过分泌各种黏附分子和细胞因子，整合到局部组织或分布全身各器官，发挥免疫调节和组织修复的作用，在神经系统、心肌梗死等方面研究较多，对于胶原相关的关节炎，如类风湿性关节炎也已进行了初步的研究，但对于与自身免疫和胶原相关的硬皮病的研究尚未见相关报道。 由于MSC在不同的自身免疫性疾病治疗中可能通过不同的作用机制发挥着不同的免疫调节和组织修复作用，故本实验拟从细胞水平和动物水平探讨MSC对硬皮病的体外模型--硬皮病成纤维细胞(humanfibroblastofsclerodermapatient，hsFb)和体内模型--硬皮病小鼠模型的作用以及其中的可能机制，为临床应用MSC治疗硬皮病提供理论依据。 材料和方法： 1.小鼠真皮间充质干细胞(Mousedermis-derivedMSCs，mdMSCs)的分离、培养和鉴定 1.1mdMSCs的分离、培养 取出生1天BALB/C小鼠，胰酶消化，培养贴壁细胞，常规传代，分别冻存。 1.2mdMSCs的鉴定 观察培养所得细胞形态，绘制生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期和表面标志、细胞纯度。 1.3mdMSCs的标记 CM-DiI荧光标记分离、纯化的mdMSCs。 2.mdMSCs对硬皮病成纤维细胞(humanfibroblastofsclerodermapatient，hsFb)的作用 2.1分离、体外培养hsFb、正常人皮肤成纤维细胞(normalhumanskinfibroblast，hnFb). 2.2将mdMSCs分别与hsFb/hnFb建立Transwell共培养体系，ELISA法检测共培养体系上清夜中TGF-β1、胶原含量(羟脯氨酸Hyp)的变化。 3.硬皮病动物模型的制备 博来霉素连续皮下注射BALB/C小鼠，每日1次，共3周，取皮肤活检，证实造模成功。 4.局部皮损内输注mdMSCs对硬皮病皮损的作用 4.1选择不同细胞密度梯度的mdMSCs局部皮损内输注予硬皮病小鼠模型。 4.2激光共聚焦显微镜显示CM-DiI标记mdMSCs硬皮病小鼠模型皮损内输注后在局部皮肤内的迁移。 4.3输注前、后皮损的变化 比较输注前后皮肤组织Masson染色显示皮肤胶原含量的变化，初步了解mdMSCs)对硬皮病小鼠皮损的作用。 结果： 1.mdMSCs分离培养第三代细胞中CD44+CD29+，CD80-CD45-细胞纯度为92.00％，CM-DiI标记mdMSCs荧光明亮清晰，细胞密度、大小与光镜下所见基本一致。 2.单独培养的hsFb和hnFb上清液Hyp含量在第4天无明显差异，第8天hsFb的Hyp分泌量较hnFb高，差异有显著性(p<0.05)。 3.mdMSCs2.5×104和mdMSCs1×104与hnFb共培养第8天上清液中Hpy含量较单独培养时明显增高，差异有统计学意义(p<0.05)；而经各细胞密度mdMSCs处理的hsFb培养上清液中Hpy含量与单独培养时无显著性差异。 4.单独培养的hsFb和hnFb上清液TGF-β1的含量在第4天时无明显差异，第8天hsFb的TGF-β1分泌量较hnFb高，差异有显著性(p<0.05)。 5.经mdMSCs2.5×104处理的hsFb培养组，在共培养第4天其上清液中TGF-β1含量较单独培养时明显增高，差异有统计学意义(p<0.05)，至共培养第8天时与单独培养时比较无差异(p>0.05)。经mdMSCs处理的各组hnFb培养上清液中TGF-β1含量于共培养第8天时均高于单独培养，差异有非常显著性(p<0.01)：经mdMSCs1×104处理的hnFb培养上清液中TGF-β1含量在第4亦高于单独培养，差异有显著性(p<0.05)。 6.不同细胞密度的MSC处理组的Hyp含量与TGF-β1水平无相关关系(r=0.221，p>0.05)；而未经MSC处理的单独培养hsFb与hnFb组其培养上清液Hyp含量与TGF-β1水平有正相关关系(r=0.682，p<0.01)。 7.BALB/C小鼠背部皮下连续注射博来霉素3周后成功诱导伴皮肤和肺部损害的硬皮病小鼠模型。 8.硬皮病小鼠模型皮肤内输注CM-DiI标记mdMSCs后可向表皮和真皮深部、毛囊处迁移。 9.mdMSCs1×107局部皮损内输注硬皮病小鼠模型后的第2和第3周，皮损区皮肤Masson染色胶原纤维组织化学指数均较未处理组低，差异有显著性(P<0.05)。 结论： 1.组织消化-细胞贴壁-传代培养法能有效培养小鼠真皮MSCs，红色荧光蛋白CM-DiI对mdMSCs细胞能进行有效的标记。 2.体外mdMSCs与hsFb共培养未能有效减少hsFbHyp和TGF-β1的分泌。 3.体外mdMSCs与hnFb共培养能增加hnFbHyp和TGF-β1的分泌，其刺激。TGF-β1的分泌呈时间依赖性。 4.mdMSCs1×107局部皮损内输注硬皮病小鼠模型可显著改善皮损的胶原含量，呈剂量依赖性。