【摘 要】
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近年来耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）不断增多,现已成为全球院内感染的首要病原菌,临床上可供选择的药物极少,已成为难以治疗的“超级细菌”,严重危害人类健康。糖肽类抗生素万古霉素是治疗MRSA感染的“最后防线”,但近来也发现耐万古霉素金黄色葡萄球菌。新近上市的利奈唑胺和达托霉素等抗MRSA药物也相继发现耐药菌
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近年来耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）不断增多,现已成为全球院内感染的首要病原菌,临床上可供选择的药物极少,已成为难以治疗的“超级细菌”,严重危害人类健康。糖肽类抗生素万古霉素是治疗MRSA感染的“最后防线”,但近来也发现耐万古霉素金黄色葡萄球菌。新近上市的利奈唑胺和达托霉素等抗MRSA药物也相继发现耐药菌,寻找新药迫在眉睫。本课题组前期研究发现,蜚蠊肠道内生放线菌WA23-2-1发酵液在体外具有较强的抗MRSA活性,且抗菌活性较稳定,但其物质基础不明,而且该菌株能分泌紫色可溶性色素,与其他分泌黄色可溶性色素的菌株不同,故本研究选取菌株WA23-2-1作为研究对象。本文利用形态学观察、分子生物学鉴定和系统发育树分析等方法对菌株WA23-2-1的菌属进行分类鉴定。在此基础上,以MRSA（ATCC 43300）为指示菌,采用单因素实验和响应面分析法优化菌株WA23-2-1发酵条件扩大发酵规模,采用琼脂扩散法检测菌株WA23-2-1发酵液上清液不同萃取部位的抗MRSA活性,运用活性追踪和化学分离相结合方法制备抗MRSA活性单体化合物;经质谱、核磁结构鉴定后,验证目标化合物的抗MRSA活性。主要实验结果如下:1.菌株WA23-2-1的生物特征分析:采用形态学观察、革兰染色法及扫描电镜等分类鉴定方法,并通过对其16S r RNA序列进行对比和系统发育树分析。结果显示,菌株WA23-2-1与一株加利福尼亚链霉菌的同源性达到99%,可初步鉴定其为加利福尼亚链菌,将菌株WA23-2-1的序列提交到Gen Bank数据库中,获得登录MN515066。2.菌株WA23-2-1发酵液不同萃取部位的抗MRSA活性:对菌株WA23-2-1发酵液乙酸乙酯部位、正丁醇部位和菌丝体部位进行抗MRSA活性追踪,确定乙酸乙酯部位和正丁醇部位为菌株WA23-2-1发酵液的活性部位,其抑菌圈直径分别为16.40±0.24 mm和13.87±0.17 mm。3.菌株WA23-2-1发酵条件优化并规模发酵:以MRSA为指示菌,对菌株WA23-2-1发酵培养条件进行单因素发酵条件优化和响应面分析。最终确定获得最佳抗菌活性天然产物的最佳发酵条件为菌悬液种龄40 h、发酵天数13 d、装液量300 m L/500 m L、培养温度29℃、培养基初始p H值6.5、接种量7%。菌株WA23-2-1在此发酵条件下提取物抗MRSA的活性最强,抑菌圈直径达18.43±0.45 mm。4.菌株WA23-2-1抗MRSA活性次级代谢产物的分离鉴定:对菌株WA23-2-1进行规模发酵,运用生物活性追踪方法结合薄层色谱法、硅胶柱色谱法、大孔树脂分离、ODS层析柱、凝胶柱色谱法（Sephadex LH-20）、高效液相色谱法（分析型、半制备型）等分离手段,对乙酸乙酯部位和正丁醇部位进行较系统的分离与纯化,共分离出6个化合物。通过核磁共振、二维核磁共振（包括COSY,HSQC,NOESY,HMBC等二维谱图）及质谱等波谱学方法并结合文献数据比对,鉴定出5个化合物分别是1-（2,4-二羟基-6-甲基苯基）乙酮、染料木黄酮、黄豆苷元、环-（D-脯氨酸-D-苯丙氨酸）和环-（D-脯氨酸-D-缬氨酸）。5.单体化合物的抗菌活性评价:分别对6个化合物的抗菌、抗真菌活性进行测定,实验结果表明化合物6对MRSA具有较强的抗菌活性,其MIC值为8μg/m L;环-（D-脯氨酸-D-苯丙氨酸）对大肠杆菌具有较强的抑制作用,其MIC值为16μg/m L;另外Genistein和Daidzein均对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有一定的抑制作用,其MIC值均大于256μg/m L。6.不同浓度的化合物6对细胞存活率的影响:分别将不同浓度的化合物6加入L02细胞作用48 h,采用MTT法检测细胞活力同时镜下观察细胞形态。与空白对照组相比,化合物6在0.78125～25μg/m L范围内对L02细胞活力无抑制作用,化合物6在50～100μg/m L范围内对L02的活力具有抑制作用,但细胞形态正常,排列规整,未出现破碎死亡现象。
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