恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病。基因表达的改变体现在肿瘤发生发展的多个环节,表现为正常基因向癌基因的转变或抑癌基因的失活等。选择性剪切是基因表达调控的一种重要方式,选择性剪切可以产生不同的基因型,与细胞生理、病理过程关联密切,并且在肿瘤的发生发展过程中发挥至关重要的作用。基因选择性剪切的机制研究将成为揭示肿瘤生长的过程、发现肿瘤治疗靶向的核心内容之一。肿瘤细胞的代谢具有不同于正常细胞的显著特点。正常细胞的代谢表现为线粒体途径的有氧氧化为主,而肿瘤细胞即使在氧气充足的条件下,也可采用糖酵解的方式来分解葡萄糖并获得能量,这就是著名的Warburg效应。其中,丙酮酸激酶M2亚型(Pyruvate Kinase Isotype M2,PKM2)是参与肿瘤Warburg效应代谢的关键酶,对肿瘤的代谢和生长调节具有重要意义。丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PKM)基因通过前体mRNA的选择性剪切产生PKM1和PKM2两种不同亚型。PKM1保留9号外显子,而PKM2保留10号外显子,虽然二者在结构上只有一个外显子的差异,但在组织定位和基因功能上却有显著不同。PKM1在需要大量产能的正常组织(如脑组织及肌肉组织)中表达,PKM2多表达于合成大量核苷酸的组织如肿瘤细胞中。PKM2参与Warburg效应,是肿瘤代谢的关键酶。然而,肿瘤组织如何调节PKM基因,并促使PKM2基因表达增多的选择性剪切机制还不清楚。本论文通过生物信息学、细胞分子生物学及RNA的选择性剪切的多种方法研究,对此问题进行了探讨和揭示。新型RBP(具有RNA结合功能的蛋白质)的发现是基因的选择性剪切调节的核心问题。在本论文中,我们运用生物信息学的方法对PKM的基因结构进行分析时,发现PKM基因9号外显子上游和10号外显子上游的内含子区域分别有STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3)和髓样锌指蛋白1(myeloid zinc finger 1,MZF1)两种蛋白的结合位点。STAT3信号是多种肿瘤细胞持续活化的信号通路,STAT3作为转录因子在肿瘤细胞增殖中发挥重要作用,然而STAT3能否作为新型RBP蛋白调控RNA水平的选择性剪切还完全不清楚。MZF1属于Kroppel相关型(C2H2型锌指)锌指蛋白家族的转录因子,含有13个C2H12型锌指,可能具备与靶分子DNA、RNA的序列特异性结合的能力,然而MZF1基因的研究才刚开始起步,MZF1的RNA结合功能存在与否更是不清楚。STAT3和MZF1两种转录因子能否作为新型RBP,调控PKM基因的选择性剪切,可能成为揭示肿瘤Warburg效应发生的重要问题。因此本论文利用多种组织和细胞比较了STAT3和MZF1的基因表达与PKM不同表达型之间的关联;并以乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞系作为研究对象,揭示了STAT3和MZF1对不同PKM基因型的调节效应,通过EMSA和RIP实验,证明STAT3和MZF1具有PKM基因RNA结合能力的RBP属性;并系统地揭示了以STAT3/MZF1作为RBP靶点调控PKM选择性剪切的分子机制,最后,通过乳酸代谢分析,建立了STAT3/MZF1调控PKM选择性剪切而调控细胞乳酸代谢的新路径。我们的研究,提供了一种PKM基因选择性剪切调节的新型分子机制。首先,我们研究丙酮酸激酶的PKM1亚型和PKM2亚型在各种细胞及组织中的表达情况。我们发现在脑、肌肉、心脏组织以及人正常的乳腺上皮细胞和胚肾上皮细胞特异性表达PKM1,而在两种乳腺癌细胞MCF7、MDA-MB-231和两种前列腺癌LNCaP、DU145细胞中特异性表达PKM2。然后,我们检测STAT3/MZF1的表达与PKM1/PKM2的mRNA水平和蛋白水平的相关性。发现肿瘤细胞和增殖组织中STAT3和PKM2表达的一致性,正常的组织和细胞中MZF1和PKM1表达的一致性。进一步,我们揭示了STAT3/MZF1的表达与PKM不同亚型转换之间的关系。我们在乳腺癌细胞中过表达及敲除STAT3,分别从蛋白水平、mRNA水平检测PKM1和PKM2表达情况的变化。实验结果显示过表达STAT3能够上调PKM2的mRNA和蛋白表达,下调PKM1的mRNA和蛋白表达;而敲除STAT3会下调PKM2和上调PKM1的基因表达。在正常乳腺上皮细胞中过表达及敲除MZF1后,我们更是意外的发现,过表达MZF1会促进PKM1的mRNA和蛋白表达,下调PKM2的mRNA和蛋白表达;敲除MZF1则会抑制PKM1促进PKM2的基因表达。上述实验结果提示,STAT3/MZF1在mRNA水平上调节PKM1/PKM2亚型的转换,提示了STAT3/MZF1可能参与PKM基因RNA水平上的选择性的剪切。证明STAT3和MZF1是否具有RNA结合能力的RBP属性是揭示其参与PKM基因选择性的剪切的核心问题和先决条件,因此,我们从体内、体外两个层面论证了STAT3/MZF1与PKM前体RNA的结合能力。首先,我们原核表达的了STAT3/MZF1的DNA结合域,通过EMSA实验证明STAT3/MZF1与PKM前体RNA的体外结合活性。结果表明,STAT3的DNA结合域能够特异结合PKM基因9号外显子上游内含子区域21bp长度的RNA序列,而MZF1能够特异结合PKM基因10号外显子上游内含子区域19bp长度的RNA序列。然后,我们通过体内的RIP实验证明STAT3能与PKM前体mRNA的9号外显子上游结合,MZF1能与PKM前体mRNA的10号外显子上游结合,这些结果证明了STAT3/MZF1是具有与RNA结合能力的新型RBP。在此基础上,我们进一步分析了STAT3/MZF1对剪切复合体的招募功能,通过免疫共沉降实验证明STAT3/MZF1能够与剪切复合体中的U1SnRNP/U2SnRNP及SR蛋白中的U2AF35/U2AF65这四种蛋白之间的相互作用,并利用U2AF35抗体的RIP实验证明了STAT3/MZF1调控的剪切复合体确实被招募到PKM前体mRNA的9号外显子上游或10号外显子上游,从而发生PKM基因的选择性剪切。这些结果系统地揭示STAT3/MZF1具有与RNA结合并招募剪切体的功能,通过选择性剪切机制调控PKM1/PKM2基因的转换。最后,我们探讨了STAT3/MZF1通过选择性剪切机制调控PKM基因转换的生理学意义。PKM2作为warburg效应的关键酶,有利于糖酵解各步反应的衔接,能够加速葡萄糖向乳酸的转化。我们发现,过表达STAT3促进肿瘤细胞生长的同时,促进了肿瘤细胞内的乳酸水平;过表达MZF1抑制肿瘤细胞生长的同时下调了肿瘤细胞内的乳酸水平。而且,我们证明STAT3和PKM2高表达于乳腺癌MCF7细胞中;而MZF1和PKM1高表达于正常乳腺上皮细胞MCF10A中。在正常乳腺上皮细胞系MCF10A细胞中STAT3的过表达会上调乳酸水平,且这种效应可以被PKM2-shRNA所阻断。最后,我们发现STAT3/MZF1在调控PKM基因剪切过程中存在着拮抗效应。STAT3能够促进PKM2的表达而抑制PKM1的表达,并且促进细胞内的乳酸积累,这种效应可以被MZF1的共表达所逆转;MZF1能够促进PKM1的表达而抑制PKM2的表达,并且下调细胞内的乳酸水平,这种效应可以被STAT3的共表达所逆转。这些结果提示了STAT3/MZF1调控PKM1/PKM2的转换进而调控细胞内的乳酸水平。综上,我们发现了两种新型的RBP:STAT3/MZF1通过选择性剪切机制调控PKM基因转换。STAT3蛋白能够在转录水平调控PKM前体mRNA的选择性剪切,使得肿瘤细胞中高表达丙酮酸激酶PKM2亚型,进而提高肿瘤细胞中有氧糖酵解的进行并促进肿瘤细胞的生长。而MZF1能够在转录水平调控PKM前体mRNA的选择性剪切,使肿瘤细胞中高表达丙酮酸激酶PKM1亚型,抑制肿瘤细胞有氧糖酵解的进行并抑制肿瘤细胞的生长。我们的研究阐明了一种新型的肿瘤相关的PKM基因的选择性剪切的调控信号通路,为肿瘤代谢靶点的调节和肿瘤的有效治疗提供了新策略和新思路。