瘢痕疙瘩成纤维细胞核转录因子-kB信号通路及其与锌指蛋白A20相关性研究

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瘢痕疙瘩(Keloid)是整形外科的常见疾病之一,是人类皮肤受损、创面愈合后局部组织过度纤维化的结果,常在易感人群中因外伤后发生,如外科手术、耳垂穿孔、注射、昆虫叮咬和烧伤等,临床上皮损超过原损伤界限,向周围正常皮肤生长,呈瘤样增生,故有“蟹足肿”之称,其好发于前胸部、肩三角区、耳部和会阴部。不仅影响人体美观,而且有不同程度的瘙痒或疼痛、甚至造成功能障碍,给患者带来极大的心理和生理负担,生活质量受到严重的影响。临床上局部应用药物治疗可暂时缓解症状,采用外科手术切除后,若不综合抗瘢痕治疗,极易复发,且向周围组织外延性生长,因此,瘢痕疙瘩一直是整形外科领域研究的重点之一。目前,瘢痕疙瘩的病因学研究涉及各种因素,包括细胞因子、生长因子的过表达,基质金属蛋白酶降解的失衡,细胞凋亡的抑制等。迄今为止,尚未发现其确切的形成原因,其组织学表现为组织过度纤维化、成纤维细胞(fibroblast, Fb)的过度增殖及合成引起细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的大量沉积。诸多研究结果表明,成纤维细胞是瘢痕疙瘩发生的始动细胞,瘢痕疙瘩中成纤维细胞在基因表达、增殖凋亡、合成分泌、胶原代谢等方面均发生了改变,这些改变导致瘢痕疙瘩中的成纤维细胞执行有别于正常成纤维细胞的生物学功能。但是,其发生促纤维化作用的具体细胞内信号转导通路机理尚不十分清楚。核因子-KκB(Nuclear faotor KB, NF-κB)是一种具有多向性调节作用的转录因子,对细胞内许多基因的表达起着关键性的调控作用。其信号传导通路贯穿于创伤修复与愈合的整个生物学过程,它是信号从细胞表面转导到细胞内部的重要传递者,参与细胞的生长、发育、凋亡等多种生理功能,并在细胞纤维化过程中起重要作用;核转录因子-κB是由两种Rel家族蛋白构成的二聚体蛋白质,以p50/p65异源二聚体最多见。主要介导Rel蛋白与DNA的结合,当细胞处于静息状态时,NF-κB的p65亚基被抑制蛋白IκBs滞留在细胞质中,不能发挥转录调节功能。NF-κB在外来信号刺激下,其抑制性蛋白IkB降解,NF-κB从中解离,进入细胞核,与细胞核内特定的DNA序列结合并发挥转录调节作用。锌指蛋白A20(zinc finger protein A20)是一种能负性调控核因子-κB(NF-κB)表达的基因调控蛋白,其在抑制NF-κB信号途径介导的细胞凋亡中具有重要的作用。目前,关于NF-κB信号转导通路在瘢痕疙瘩中研究甚少,锌指蛋白A20的表达变化及其与NF-κB的相互关系在瘢痕疙瘩中尚无研究。本实验拟以正常皮肤和瘢痕疙瘩为研究对象,通过采用免疫组织化学染色、体外培养成纤维细胞、提取成纤维细胞总RNA、采用实时定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)等多种技术,对锌指蛋白A20、核转录因子-κB在瘢痕疙瘩、正常皮肤以及正常皮肤成纤维细胞和瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达变化进行研究,探讨核转录因子-KB信号通路、锌指蛋白A20对瘢痕疙瘩形成是否具有作用以及其对成纤维细胞增殖、凋亡的作用。将为深入研究瘢痕疙瘩的形成机制、完善调控瘢痕疙瘩的信号转导通路、为预防瘢痕疙瘩的形成和寻找可能作用的治疗靶点提供理论依据。研究目的1.检测锌指蛋白A20和NF-κB在正常皮肤组织及瘢痕疙瘩组织中的表达。2.了解体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长增殖与体外培养正常皮肤来源的成纤维细胞的差异,以及二者进入对数生长期的时间。3.检测锌指蛋白A20和NF-κB在体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞中mRNA的表达。4.了解核转录因子-κB信号通路的激活情况及其与瘢痕疙瘩形成的相互关系,为探索新的预防和治疗瘢痕疙瘩的方法提供思路。材料瘢痕疙瘩标本共16例,其中男性6例,女性10例,年龄18~42岁,平均32.60±0.38岁,取材部位包括耳垂、前胸等部位,病程为6个月~10年,平均3.40±0.60年。外观发红充血、质硬、高出皮肤表面,局部伴瘙痒或疼痛等不适,无感染和溃疡,未曾应用抗瘢痕药物、弹力加压、放疗等方法治疗。正常皮肤16例,男9例,女7例,年龄2-54岁,平均年龄23.54±0.42岁。取材部位为上臂内侧、腹部全厚植皮术修剪后剩余皮片。各标本均有详细的完整病历和随访记录,所取标本之患者无合并皮肤疾病、结缔组织病和其它重要脏器疾病;术前均未行放疗、激光治疗及免疫治疗;所有标本均经病理证实。方法1取人正常皮肤组织和瘢痕疙瘩组织标本,制作石蜡切片,应用免疫细胞化学染色技术检测锌指蛋白A20和NF-κB的表达,观察其在正常皮肤及瘢痕疙瘩中表达的差异。2应用组织微粒贴壁法,体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肽成纤维细胞,绘制二者生长曲线,通过细胞计数法对体外培养的正常皮肽和瘢痕疙瘩组织成纤维细胞生长曲线测定比较,了解瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长增殖与正常皮肤来源的成纤维细胞的差异,观察二者进入对数生长期的时间是否相同。3以瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞为研究对象,将第4代成纤维细胞用于实验,应用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)技术检测NF-κB和锌指蛋白A20mRNA的表达,以明确其在体外培养的成纤维细胞中各自的表达特征。结果1人正常皮肤组织中和瘢痕疙瘩组织中NF-κB p65的表达免疫组织化学染色结果表明,NF-κB p65定位于成纤维细胞胞浆和胞核,正常情况下呈棕黄色颗粒,胞核几乎无染色;活化后进入核内,表现为核染色;NF-κp65在瘢痕疙瘩中的大部分成纤维细胞胞核阳性表达,阳性表达率为87.50%(14/16);在人正常皮肤中的大部分成纤维细胞胞核呈阴性表达,阳性表达率为6.25%(1/16)。二者比较,差别具有显著性意义(P<0.05)。2人正常皮肤组织中和瘢痕疙瘩组织中锌指蛋白A20的表达免疫组织化学染色结果表明,锌指蛋白A20染色阳性信号为棕黄色颗粒,定位于细胞浆内。锌指蛋白A20在瘢痕疙瘩成纤维细胞胞浆中呈弱阳性表达,阳性表达率为18.75%(3/16);锌指蛋白A20在人正常皮肤成纤维细胞胞浆呈阳性表达中,阳性表达率为87.50%(14/16)。二者比较,差别具有显著性意义(P<0.05)。3体外培养的正常皮肤成纤维细胞和瘢痕疙瘩组织成纤维细胞生长曲线比较瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长增殖与正常皮肤来源的成纤维细胞无明显差异,二者进入对数生长期的时间大致相同。4体外培养的成纤维细胞冻存后的复苏情况体外培养的成纤维细胞在液氮中冻存后,细胞复苏状态良好,接种后绝大部分细胞存活,生长旺盛,存活率达85%,在倒置相差显微镜下观察细胞形态与冻存前无明显差异。5人正常皮肤成纤维细胞中和瘢痕疙瘩成纤维细胞中NF-κB mRNA的表达通过实时荧光定量RT-PCR显示:NF-κB mRNA在正常皮肤成纤维细胞中的表达量减少,在瘢痕疙瘩成纤维细胞中NF-κB mRNA的表达量显著增加,二者比较,差别具有显著性意义(P<0.05)。6人正常皮肤成纤维细胞中和瘢痕疙瘩成纤维细胞中锌指蛋白A20 mRNA的表达通过实时荧光定量RT-PCR显示:锌指蛋白A20 mRNA在正常皮肤成纤维细胞和瘢痕疙瘩的成纤维细胞中均有表达,在正常皮肤成纤维细胞中A20 mRNA的表达量多于瘢痕疙瘩成纤维细胞中A20 mRNA表达量,二者比较,差别具有显著性意义(P<0.05)。结论1 NF-κB在瘢痕疙瘩组织中的高表达,说明其信号通路异常可能参与瘢痕疙瘩的形成,并介导瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖。2 A20在瘢痕疙瘩中的低表达,说明瘢痕疙瘩形成机制可能与A20对核转录因子-κB的抑制减弱有关。3正常皮肤组织和瘢痕疙瘩组织中成纤维细胞的生长增殖无明显差异,二者进入对数生长期的时间大致相同。4瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞及正常皮肤来源的成纤维细胞可成功冻存和复苏。。
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