论文部分内容阅读
为了探讨高糖和AGEs致纤维化的分子机制，本研究拟采用基因转染抑制性Smad7的方法，进行下列三方面的观察：1、Smad7对TGF-β1介导肾小管上皮细胞转分化及Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)合成的影响；2、Smad7对高糖介导肾小管上皮细胞转分化及CollagenⅠ合成的影响；3、Smad7对AGEs介导肾小管上皮细胞转分化及CollagenⅠ合成的影响。
探讨了Smad7对TGF-β1介导肾小管上皮细胞转分化及CollagenⅠ合成的影响。方法：1、强力霉素(Dox)调控Smad7表达NRK52E细胞株的构建：应用lipofect2000将含有小鼠全长Smad7cDNA的Tet-on质粒系统先后转染至正常大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E)，G418培养基和含有潮霉素的培养基两轮筛选后，最后通过鉴定选择Smad7表达受Dox调控的克隆，扩增后冻存备用。2、细胞培养及分组：待生长状况良好的NRK52E细胞和转染Smad7的NRK52E细胞株60-80％细胞贴壁后，无血清培养基同步24小时，然后根据分组给予相应的刺激。NRK52E细胞给予不同浓度和时间TGF-β1刺激；Smad7转染NRK52E细胞分强力霉素组和对照组，前者给予Dox(2ug/ml)诱导24h后，给予TGF-β1(10ng/ml)刺激，对照组不给Dox诱导。3、指标检测：采用细胞免疫化学方法检测0、2、4、8、10ng/ml的TGF-β1浓度刺激30分钟，以及TGF-β1(10ng/ml)刺激0、15min、30min、1h、3h后p-Smad2/3核转位情况；RT-PCR检测0h、6h、12h、24h、48h、72h，120不同时间点Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA、E-cadherin和CollagenⅠmRNA的表达；Westernblot方法检测0h、48h、72h不同时间点α-SMA、E-cadherin和CollagenⅠ蛋白的表达水平。结果：与刺激前比较，TGF-β1以时间和剂量依赖方式上调NRK52E细胞p-Smad2/3核转位，高峰发生在30min(73.1％vs15.8％阳性细胞百分数)；与刺激前比较TGF-β1以时间依赖方式上调Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA、CollagenⅠmRNA的表达，下调E-CadhennmRNA的表达。Dox以剂量依赖方式上调转染NRK52E细胞株Smad7mRNA和蛋白的表达，而且Dox可进一步上调TGF-β1介导的Smad7mRNA和蛋白的表达。Smad7高表达能抑制TGF-β1介导的p-Smad2/3的核转位，并下调Smad2和Smad3mRNA的表达。下调TGF-β1介导的α-SMA、CollagenⅠmRNA和蛋白的表达，上调E-CadherinmRNA和蛋白的表达。结论：Smad7可阻抑TGF-β1介导的近端肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质CollagenⅠ的合成，这一效应与其抑制Smad2和/或Smad3的活化有关。
探讨了Smad7对高糖介导肾小管上皮细胞转分化及CollagenⅠ合成的影响。方法：1、细胞培养及分组：待生长状况良好的NRK52E细胞和转染Smad7的NRK52E细胞株60-80％细胞贴壁后，无血清培养基同步24小时，然后根据分组给予相应的刺激。NRK52E细胞分高糖组(35mmol/L)和甘露醇对照组(35mmol/L)，TGF-β1中和抗体组(高糖刺激前30分钟加入TGF-β1中和抗体5μg/ml)，IgG1对照组(高糖刺激前30分钟加入同源IgG15μg/ml)；Smad7转染NRK52E细胞分Dox组和对照组，前者给予Dox(2ug/ml)诱导24h后，给予高糖刺激，后者不加Dox诱导。2、指标检测：采用细胞免疫化学方法检测5.5、15、25、35、45mmol/L不同葡萄糖浓度刺激24h，以及高糖刺激0、15min、30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h后p-Smad2/3核转位情况；ELISA检测高糖刺激0、24和48小时后细胞培养上清中TGF-β1的浓度；RT-PCR检测0h、12h、24h、48h、72h不同时间点Smad2、Smad3、Smad7、TGF-β1、α-SMA、E-cadherin和CollagenⅠmRNA的表达；Westernblot方法检测0h、48h、72h不同时间点α-SMA、E-cadherin和CollagenⅠ蛋白的表达水平。结果：与刺激前和甘露醇对照组比较，高糖明显上调NRK52E细胞p-Smad2/3核转位，高峰在24小时；上调Smad2、Smad3、Smad7、TGF-β1mRNA的表达，且能明显增加24和48小时细胞上清中TGF-β1的浓度；上调α-SMA、CollagenⅠmRNA和蛋白的表达，下调E-CadherinmRNA和蛋白的表达。与IgG1对照组比较，TGF-β1中和抗体不仅能抑制高糖介导p-Smad2/3的核转位，下调Smad2、Smad3、Smad7mRNA的表达，并能下调α-SMA、CollagenⅠmRNA和蛋白的表达，上调E-CadherinmRNA和蛋白的表达。Dox能进一步上调高糖介导转染NRK52E细胞Smad7mRNA和蛋白的表达，Smad7高表达能抑制高糖介导的p-Smad2/3的核转位，显著下调Smad2和Smad3mRNA的表达，下调高糖介导的α-SMA、CollagenⅠmRNA和蛋白的表达，上调E-CadherinmRNA和蛋白的表达。
结论：高糖介导的近端肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质CollagenⅠ的合成依赖于TGF-β1效应。Smad7阻抑高糖介导的上述效应依赖于对Smad2和(或)Smad3活化的抑制作用。探讨了Smad7对AGEs介导肾小管上皮细胞转分化及CollagenⅠ合成的影响。方法：1、糖基化终产物(AGE-BSA)的制备：牛血清白蛋白(BSA40mg/ml)溶解于含有0.2MD-葡萄糖的PBS溶液中，无菌条件下37℃孵育8周，经PBS透析72小时后，通过荧光分光光度计鉴定AGE-BSA的生成；2、细胞培养及分组：待生长状况良好的NRK52E细胞和转染Smad7的NRK52E细胞株60-80％细胞贴壁后，无血清培养基同步24小时，然后根据分组给予相应的刺激。NRK52E细胞分AGE-BSA组(200μg/ml)和BSA对照组(200μg/ml)，TGF-β1中和抗体组(AGE-BSA刺激前30分钟加入TGF-β1中和抗体5μg/ml)，IgG1对照组(AGE-BSA刺激前30分钟加入同源IgG15μg/ml)；Smad7转染NRK52E细胞分强力霉素组和对照组，前者给予Dox(2ug/ml)诱导24h后，给予AGE-BSA刺激，后者不加Dox诱导。2、指标检测：采用细胞免疫化学方法检测0、50、100、200、400μg/ml不同AGE-BSA浓度刺激30min和24h，以及AGE-BSA刺激0、15min、30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h后p-Smad2/3核转位情况；ELISA检测AGE-BSA刺激0、24和48小时后细胞培养上清中TGF-β1的浓度；RT-PCR检测0h、6h、12h、24h、48h、72h、120h不同时间点Smad2、Smad3、Smad7、TGF-β1、α-SMA、E-cadherin和CollagenⅠmRNA的表达；Westernblot方法检测0h、48h、72h不同时间点α-SMA、E-cadherin和CollagenⅠ蛋白的表达水平。结果：与刺激前和BSA对照组比较，AGE-BSA明显上调NRK52E细胞p-Smad2/3核转位，高峰在30min和24小时；上调Smad2、Smad3、Smad7、TGF-β1mRNA的表达，且能明显增加24和48小时细胞上清中TGF-β1的浓度；上调α-SMA、CollagenⅠmRNA和蛋白的表达，下调E-CadherinmRNA和蛋白的表达。与IgG1对照组比较，TGF-β1中和抗体能抑制AGE-BSA介导24小时p-Smad2/3的核转位，但对30min的p-Smad2/3的核转位高峰无明显影响；TGF-β1中和抗体可下调AGE-BSA介导Smad2、Smad3、Smad7mRNA的表达，以及α-SMA、CollagenⅠmRNA和蛋白的表达，上调E-CadherinmRNA和蛋白的表达。Dox能进一步上调AGE-BSA介导转染NRK52E细胞Smad7mRNA和蛋白的表达，Smad7高表达能抑制AGE-BSA介导的30min和24小时p-Smad2/3的核转位，显著下调Smad2和Smad3mRNA的表达，下调AGE-BSA介导的α-SMA、CollagenⅠmRNA和蛋白的表达，上调E-CadherinmRNA和蛋白的表达。结论：AGEs介导的Smads信号蛋白的活化存在依赖和非依赖TGF-β1途径，Smad7阻抑AGEs介导的近端肾小管上皮细胞转分化和CollagenⅠ合成依赖于对Smad2和/或Smad3活化的抑制作用。