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目的子痫前期血清中胎盘缺氧滋养细胞来源的sFlt-1增加与尿蛋白的产生相关,但是,滋养细胞缺氧分泌sFlt-1导致尿蛋白的上下游分子调控机制不明。HIF1α/2 α是滋养细胞缺氧的主要应激因子,有研究发现,Flt-1为HIF1α/2 α的靶基因;本课题组前期研究发现,子痫前期血清可通过增加CAV1表达促进肾小球血管内皮细胞(humanrenal glomerular vascular endothelial cells,HRGECs)对大分子蛋白(higher molecular weight protein,HMWP)的通透性。基于以上研究基础,本文探讨HIF1α/2 α-Flt1/sFlt-1-CAVl信号转导在子痫前期(preeclampsia,PE)血清及缺氧培养滋养细胞培养上清(conditioned medium,CM)导致HRGECs通透性增加的病理过程中的作用。方法1、收集20例PE患者及20例正常孕妇外周血清及胎盘组织,ELISA检测孕妇外周血中sFlt-1含量,Western blot及免疫组织化学技术检测胎盘中HIF1α、HIF2 α及Flt-1的表达与可能的细胞来源,分析正常与PE患者外周血sFlt-1与胎盘组织HIF1α、HIF2 α、Flt-1间的表达差异;2、前期研究发现PE血清可通过CAV1增加HRGECs对HMWP通透性,现检测PE血清影响HRGECs通透性是否经由sFlt-1-CAV1信息通路介导。HRGECs细胞接种transwell小室,血清培养分组:正常孕妇血清处理组(NG组),PE血清处理组(PE组),NG组+rsFlt-1处理组,PE血清+sFlt-1抑制剂axitinib处理组,PE血清+CAV1抑制剂MBCD处理组。Evens-blue检测HRGECs对大分子蛋白通透性改变,Western blot技术检测caveolin-1(CAV1)蛋白表达;3、体外细胞实验进一步明确PE血清中sFlt-1增加是否来源于缺氧滋养细胞及HIF1 α、HIF2 α对其的调控作用。体外缺氧处理HTR-8/SVneo细胞,JC1染色检测缺氧对细胞线粒体损伤情况,western blot及RT-qPCR检测细胞中HIF1α、HIF2 α及Flt1的表达,ELISA检测细胞培养上清中sFlt-1表达。利用HIF1α、HIF2 α过表达质粒及siRNA干扰技术转染HTR-8/SVneo细胞,细胞培养分组为:常氧环境下up-HIF1α、up-HIF2α、Normo-Ctr、Normo-lip3000、Normo-Scramble;缺氧环境下si-HIF1α、si-HIF2α、Hypo-Ctr、Hypo-lip3000、Hypo-Scramble。westernblot及RT-qPCR检测细胞中Flt-1的表达,ELISA检测细胞培养上清中sFlt-1 表达。4、检测缺氧培养滋养细胞CM是否通过HIF1 α/HIF2 α-sFlt-1-CAVl信息途径增加HRGECs对HMWP的通透性。利用CM处理HRGECs,分组为:Ctr、Normo-CM、Hypo-CM、up-HIF1α CM、up-HIF2α CM、up-HIF1α+2α CM、si-HIF1 α CM、si-HIF2α CM、si-HIF1α+2α CM、Hypo-CM+axitinib、Hypo-CM+MBCD。Evens-blue检测HRGECs对HMWP通透性改变,western blot及细胞免疫荧光技术检测细胞CAV1蛋白表达情况。结果1、PE孕妇血清中sFlt-1含量及胎盘组织中HIF1 α、HIF2 α及Flt-1的蛋白表达量明显高于正常对照组(P<0.05);PE血清、rsFlt-1可促进HRGECs对HMWP通透性及CAV1蛋白表达(P<0.05);sFlt-1拮抗剂axitinib可抑制PE血清促进HRGECs对HMWP通透性与CAV1蛋白表达的作用;CAV1拮抗剂MBCD可抑制PE血清促进HRGECs对HMWP通透性(P<0.05)。PE患者血清可能通过sFlt-1-CAVl信息途径增加HRGECs对HMWP的通透性。2、缺氧培养HTR-8/SVneo细胞HIF1 α、HIF2 α及Flt-1的表达明显增加,缺氧培养 HTR-8/SVneo 细胞 CM 中 sFlt-1 含量明显增加(P<0.05)。HIF1 α、HIF2 α过表达可促进HTR-8/SVneo细胞中Flt-1及CM中sFlt-1表达(P<0.05);单独抑制HIF1 α或HIF2 α后缺氧处理HTR-8/SVneo细胞,Flt-1及CM中sFlt-1表达未明显降低(P>0.05),而共同抑制HIF1 α和HIF2 α表达后缺氧处理HTR-8/SVneo细胞Flt-1及CM中sFlt-1表达可明显降低(P<0.05)。3、HTR-8/SVneo 细胞缺氧 CM(Hypo-CM)及 HIF1 α、HIF2 α 过表达 HTR-8/SVneo细胞 CM(up-HIF1 α CM/up-HIF2 α CM/up-HIF1 α+2 α CM)可增加HRGECs 对 HMWP的通透性及CAV1蛋白表达,sFlt-1抑制剂axitinib及CAV1抑制剂MBCD可抑制缺氧CM诱导的HRGECs对HMWP的通透性,axitinib可抑制sFlt-1诱导的HRGECs CAV1蛋白的表达增加。结论PE孕妇血清中sFlt-1含量及胎盘组织中HIF1α、HIF2α及Flt-1的蛋白表达量明显高于正常对照组;PE血清、HTR-8/SVneo细胞缺氧CM可能通过HIF1α/2α-Flt-1/sFlt-1-CAVl 信号通路促进 HRGECs 对HMWP的通透性,HIF1α/2α-Flt-1/sFlt-1-CAVl信息通路的激活可能参与了PE患者蛋白尿产生的病理过程。