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目的黏多糖病(mucopolysacchridoses,MPS)是一组由于酶缺陷造成的酸性黏多糖分子不能降解的溶酶体贮积病。临床上至少包括I、II、III、IV、VI、VII和IX共7型,涉及11种水解酶。随着造血干细胞移植及酶替代治疗的逐步开展,MPS成为可治疗的遗传代谢病,早期诊断和早期治疗是改善预后的关键。酶学分析是疾病诊断的重要依据。本课题研究目的如下:1.建立适合临床应用的酶学分析方法及其正常参考值;2.对临床上高度疑似的黏多糖病患儿进行酶学分型诊断;3.评估尿黏多糖(glucosamnoglycan,GAG)及血清壳三糖苷酶测定在MPS筛查中的地位;4.总结各型MPS的临床特点。对象和方法1.对象:(1)病例组: 2008年6月-2010年12月广州市妇女儿童医疗中心内分泌代谢科根据临床表现及X线检查结果,高度疑似MPS患儿共36例,其中男25例,女11例,年龄0.2～10.8岁,平均(4.2±2.3)岁,所有患儿均进行了尿GAG定量及电泳分析。其中32例在我院采集了外周血并进行了外周血白细胞酶学分析和血清壳三糖苷酶活性测定。(2)正常对照组:63例,均为广州市妇女儿童医疗中心保健科门诊体检的健康儿童,年龄1.3～13岁。2.酶测定:包括下列六种常见MPS酶:а-L-艾杜糖酶(MPS I),艾杜糖醛酸硫酸酯酶(MPSII),半乳糖胺-6-硫酸酯酶(MPS IVA),β-半乳糖苷酶(MPS IVB),芳基硫酸酯酶B酶(MPS VI),β-葡萄糖醛酸酶(MPS VII)。右旋糖酐法分离白细胞,超声波破碎仪制备细胞匀浆,二喹啉甲酸蛋白检测试剂盒(BCA)测定蛋白含量。采用底物荧光法测定上述六种MPS酶活性。采用1,9二甲基亚甲蓝(DMB)-Tris比色法定量测定尿GAG含量,琼脂糖凝胶电泳进行尿GAG定性分析,底物荧光法测定血清壳三糖苷酶活性。对高度怀疑MPS VI型者同时采用比色法测定芳基硫酸酯酶B酶活性。结果1.建立了底物荧光法测定外周血白细胞六种常见MPS酶活性测定方法,同时建立了芳基硫酸酯酶B比色法。各种方法的批内变异系数均在6%以内,批间变异系数均在10%以内。2.建立了白细胞六种常见MPS酶活性正常参考值:а-L-艾杜糖酶(MPS I):69.7±23.8 nmol/(mg.h);艾杜糖醛酸硫酸酯酶(MPSII):77.1±33.9 nmol/(mg.4h);半乳糖胺-6-硫酸酯酶(MPS IVA):153.7±37.9 nmol/(mg.17h);β-半乳糖苷酶(MPS IVB):94.2±32.1 nmol/(mg.h);芳基硫酸酯酶B(MPS VI,荧光法):116.6±37.7 nmol/(mg.h);β-葡萄糖醛酸酶(MPS VII):151.6±45.8 nmol/(mg.h)。芳基硫酸酯酶B(比色法):1.7±0.5 U/g蛋白。3.高度疑似MPS患儿酶学分型:32例在我院采集外周血的高度疑似MPS患儿全部确诊为MPS,其中I型4例(占12.5%),II型11例(占34.3%),IVA型12例(占37.5%),VI型4例(占12.5%),VII型1例(占3.2%),未发现IVB型的患儿。MPS VI型患儿白细胞芳基硫酸酯酶B活性显著降低,比色法与底物荧光法检测结果一致。4.在确诊的32例患儿中,31例尿GAG浓度及尿GAG/Cr比值显著增高,仅1例IVA型患儿尿GAG定量基本正常,阳性率96.9%。电泳分析显示31例异常,其中I、II、VI、VII型患儿尿硫酸皮肤素(DS)阳性,11例IVA型患儿尿硫酸软骨素(CS)阳性,另1例未见异常。尿GAG定量与电泳分析阳性符合率100%。6例MPS患儿(18.8%,1例Ⅰ型、4例ⅣA型、1例VII型)血清壳三糖苷酶活性轻度增高(60.5～315.8μmol/l.h)。5.各型MPS临床特点:MPS具有明显的遗传异质性,表现为不同程度的多系统损伤。其中I型、II型、VI型患者面容丑陋、关节僵硬、生长迟缓等,尿GAG定量和电泳均明显异常。IVA型患儿临床表现主要为生长迟缓,骨骼畸形,关节松弛,智力正常,尿GAG定量和电泳结果可正常。MPS VII型罕见,表现为水肿胎、血小板减少、外周血白细胞胞浆Alder-Reilly颗粒。结论1.建立了以底物荧光法为主的外周血白细胞六种常见MPS酶活性测定方法,具有良好的稳定性、特异性和敏感性,操作相对简单、快速,适合临床推广应用。2.建立了外周血白细胞六种常见MPS酶活性正常参考值。3.在32例MPS患儿中,首次发现MPS IVA型最常见,其次是MPS II型,发现国内首例MPS VII型患儿。4.除少数IVA型患儿外,尿GAG定量和电泳仍是一种经济、快速、可靠的MPS筛查方法。5.仅少数MPS患儿血清壳三糖苷酶轻度增高,该酶尚不能作为MPS常规生化标记物用于疾病筛查和诊断。6. MPS的临床表现具有显著异质性,常累积多个器官,多学科合作可提高疾病诊治水平,改善患儿预后。