论文部分内容阅读
研究背景:铬(chromium,Cr)是一种天然的元素,在大气,土壤,岩石,微生物,植物以及动物体内都有发现。它主要以三价铬[Cr(III)]和六价铬[Cr(VI)]这两种价态的形式存在于自然界。其中Cr(VI)是已知的致癌剂。工业生产过程中的Cr(VI)是导致工人职业性肺癌的重要原因。长期暴露在污染的Cr(VI)环境中会对人体健康产生严重的危害,如肝肾器官损害、接触性皮炎、皮肤癌等。Cr(VI)导致的细胞氧化应激和DNA损伤是肿瘤形成的主要原因。除肺癌外,Cr(VI)还可导致消化道肿瘤等,但其具体机制还有待研究。URI(unconventional prefoldin RPB5 interactor,URI)属于前折叠素家族,可以与RNA聚合酶的亚基RPB5蛋白结合,主要参与多种基因转录水平的调控。研究结果表明,URI对维护线虫和果蝇基因组的稳定性发挥重要的作用,URI沉默后,会导致DNA损伤的累积从而导致细胞凋亡。URI也被认为是一个促癌蛋白,能够促进多种肿瘤细胞的增殖,并抵抗细胞凋亡。研究还发现URI是一种放射敏感蛋白。而重铬酸钾是一种常见的Cr(VI)盐,已被证实是一种化学致癌剂,但对其致癌机制目前尚不清楚。研究目的:对正常细胞而言,重铬酸钾具有细胞毒性和致瘤性。但肿瘤细胞对重铬酸钾处理后会有什么反应?面对细胞毒性,加强DNA损伤的修复和逃避死亡是肿瘤细胞的特性,而URI是一个癌蛋白,URI在重铬酸钾诱导的肿瘤细胞氧化应激﹑DNA损伤等过程中是否具有保护作用?本研究通过敲低SGC-7901细胞中URI的表达,研究在重铬酸钾诱导SGC-7901细胞ROS产生,DNA损伤及修复,细胞死亡过程中URI的作用,进一步丰富对URI功能的理解,也为URI在重铬酸钾诱导肿瘤的形成过程提供新的思路。研究方法:(1)应用si RNA沉默技术在人胃癌细胞SGC-7901中敲低URI,设置si RNA-A干扰组,Scrambled无关序列组和Blank空白组。并采用免疫印迹方法检测其表达水平,验证URI敲低效果。(2)用DCH-DA试剂盒分别用流式以及荧光方法检测上述各组细胞在重铬酸钾作用后细胞内DCF的荧光强度,以此反映细胞ROS水平。(3)用彗星实验检测各组细胞在相应重铬酸钾处理后的OTM值,设置重铬酸钾的浓度(1μM,10μM),用OTM值反映细胞DNA损伤程度及修复效率。(4)用Annexin V/PI染色试剂盒通过流式细胞术检测各组细胞在重铬酸钾处理后的细胞凋亡及坏死。(5)免疫印迹和免疫荧光方法检测各组细胞在重铬酸钾处理后相应蛋白的表达,包括抗凋亡蛋白Bcl-2,Mcl-1和促凋亡蛋白Bax以及凋亡诱导因子AIF等。(6)NAD+测定试剂盒检测各组细胞在相应重铬酸钾处理后细胞中NAD+的含量。研究结果:(1)URI干扰后,重铬酸钾诱导SGC-7901细胞的ROS产生明显增加。(2)URI干扰后,重铬酸钾诱导SGC-7901细胞的DNA损伤明显增加,且在相对高浓度的重铬酸钾作用SGC-7901细胞后,URI干扰后抑制了细胞对DNA损伤修复的能力。(3)相对低浓度的重铬酸钾导致SGC-7901细胞的死亡主要是依赖线粒体途径的凋亡,而相对高浓度重铬酸钾作用SGC-7901细胞主要是依赖PARP1途径的坏死。并且URI干扰后,这两种细胞的死亡都明显增加。结论:(1)URI能够抑制重铬酸钾诱导的细胞ROS产生,说明URI参与了重铬酸钾诱导细胞氧化应激的调节。(2)URI能降低重铬酸钾诱导的细胞DNA损伤,URI干扰后显著抑制了细胞在10μM浓度重铬酸钾作用后DNA损伤的修复效率。提示URI能影响重铬酸钾诱导的细胞DNA损伤及其修复。(3)URI对重铬酸钾作用下的细胞存活发挥作用,URI能抵抗重铬酸钾诱导的细胞死亡。