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Lipin1作为lipins家族蛋白的一员,具有磷脂酸磷酸酶和脂质代谢共转录调控子的双功能,也参与其它许多细胞代谢过程,但是lipin1在相关的细胞代谢中的作用仍不十分清楚。本论文首先构建了 lipin1过表达的肝癌细胞BEL7402稳定细胞系,研究发现lipin1过表达促进PPARα和SREBP1的表达,减少甘油三酯的合成,降低胞内甘油三酯的含量;同时还发现lipin1过表达可以诱导细胞G0/G1期阻滞、减缓肝癌细胞的增殖。为了阐明lipin1在肝癌细胞周期阻滞的调控作用,我们应用蛋白组学技术[双向多聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)]分析lipin1过表达对细胞蛋白组表达的影响。结果显示,与对照相比lipin1过表达使7个蛋白的表达水平出现了差异性变化,其中核纤层蛋白lamin A/C表达水平上调最显著。有研究发现p53-p21轴参与由lamin A/C表达抑制引起的细胞增殖。因此,我们检测了 lipin1过表达诱导的lamin A/C表达上调是否也与p53-p21轴有关联。蛋白质分子印迹实验的结果显示,lipin1过表达诱导肿瘤抑制子p53以及其下游p21和p27的表达上调;相反,用siRNA技术敲减lipin1后,p53和p21的表达下调,细胞增殖加快并伴随着lamin A/C表达降低。以上结果表明lipin1通过lamin A/C-p53-p21信号通路诱导细胞周期阻滞和抑制肝癌细胞增殖的作用,而Erk1/2没有参与这一过程。其次,金属离子在多种生命过程(包括增殖和细胞周期)中发挥至关重要的作用,有研究报道,细胞内铁离子水平可以通过p53-p21-p27介导的信号通路调控细胞周期。我们检测了细胞内8种金属离子(钾、钙、钠、镁、锰、锌、铁和铜)的含量,结果显示,lipin1过表达仅显著减少胞内铁的含量,而对其它的金属离子没有影响。铁相关蛋白的mRNA表达水平的分析表明,细胞内铁的减少与lipin1过表达的稳定细胞系中铁输出蛋白ferroportin(膜铁转运蛋白)的表达增加呈正相关;蛋白质分子印迹分析进一步证明,过表达的lipin1上调ferroportin的表达。相反,lipin1 siRNA抑制lipin1表达后,细胞内铁含量由于ferroportin表达的减少而增加。同时,lipin1调节铁稳态过程中p53-p21的表达也发生相应的变化。这些研究结果说明,lipin1可能通过干扰胞膜铁转运蛋白表达,降低细胞铁离子水平,经过p53-p21-p27介导的信号通路调控细胞周期。该研究结果也再次表明铁的减少可能是癌症预防和治疗的潜在策略。最后,为进一步研究细胞增殖过程中lipin1的调控作用,我们在人胚胎肾细胞293T中瞬时转染质粒pcDNA3.1/myc-HisA-lipin1,利用pull down与质谱相结合的方法,希望揭示lipin1的蛋白-蛋白相互作用网络。本论文使用Ni2+柱pull down方法,从表达6-His标记的lipin1的293T细胞中分离得到lipin1蛋白复合物,并利用Q Exactive质谱仪分析这些lipin1蛋白复合物。通过Proteome Discoverer软件平台,非标记定量的质谱数据中找到了 30个与lipin1互作的蛋白质,而这些蛋白在转染空载pcDNA3.1-myc-HisA的细胞中都未发现。其中,eEFIA1作为其中的一员,蛋白免疫共沉淀和细胞免疫荧光共定位实验进一步证明,在表达6-His标记的lipin1的293T细胞和肝细胞SMMC7721中,lipin1与eEFIA1之间具有物理相互作用。并且,SMMC7721细胞中的蛋白免疫共沉淀实验证实了 lipin1也与HIST1H2BK相互作用。同时,利用2D-PAGE和MALDI-TOF/TOF MS在过表达lipin1的293T细胞中研究蛋白质组学变化,发现了 11个差异表达的蛋白。在这11个蛋白中,3个蛋白(eEF-1Bγ,CCT1和CCT3)表达上调,其余 8 个蛋白(NDKA,Stathmin,HNRNP A1,TK,KRT1,PKM,RanBP1 和 LDHB)表达下调。蛋白质分子印迹分析进一步证明,瞬时过表达lipin1的293T细胞中RanBP1的表达降低。生物信息学分析表明,这些蛋白与细胞内的组成成分、代谢过程、催化活性和分子伴侣有关,也再一次提示lipin1在细胞中扮演着多重角色。另外,为了研究lipin1作为治疗非酒精性脂肪肝(NAFLD)的潜在药物靶点的可能性,本论文研究了一些药物干扰NAFLD的效果及lipin1的生物学效应。我们利用油酸诱导人肝癌细胞SMMC7721,建立NAFLD体外模型,发现从艾蒿中分离得到的用于有效治疗不同疟疾的倍半萜内酯内过氧化物-青蒿素,可以降低NAFLD体外模型的胞内脂积累和TAG浓度。通过逆转录PCR、逆转录实时荧光定量PCR和Western blotting方法,分析了青蒿素对SMMC7721细胞的脂合成和脂分解基因表达的影响。结果发现,青蒿素可以减少CD36的mRNA和蛋白的表达,但对lipin1、PPARα和SREBP1的表达没有影响。因此,青蒿素主要通过抑制NAFLD体外模型中CD36的表达,减少肝细胞内脂积累并降低甘油三酯含量。遗憾的是目前还未筛选到以lipin1为调控靶点的化合物。总之,本论文的研究表明,除了调控脂质代谢外,肝癌细胞中lipin1还具有通过lamin A/C-p53-p21介导的信号通路调控细胞增殖的作用。同时,我们首次发现lipin1参与人肝癌细胞中铁稳态的调节。但lipin1在不同肿瘤细胞中表达水平有很大差异,需要进一步研究在不同类型肿瘤细胞中,lipin1与细胞内铁水平两者之间的直接关系,以明确这一结果的临床意义。此外,通过His pull down结合nano-LC/ESI/MS/MS的方法,还发现了 30个lipin1相互作用蛋白,为进一步研究lipin1的细胞功能打下基础。本论文的研究结果将有助于提高对lipin1参与的细胞代谢调控的认识,并期望扩大对lipin1新功能的了解。