树木的次生生长决定着木材的产量,搞清次生生长的分子机理具有重要的科学意义和经济价值。木材的次生生长包括维管组织的建立、次生细胞壁的产生及沉积、细胞程序性死亡及心材形成等多个过程。在木材形成的过程中,植物激素特别是赤霉素(Gibberellin,GA)与生长素(Auxin),被认为对维管组织的形成尤其是维管形成层的发育具有关键的调控作用。已有的研究表明,在木本植物去顶的植株中,外源施加赤霉素可促进维管组织的次生发育,增强维管形成层的分裂活性。生长素通过ARF(auxin response factor)响应元件介导信号传递,调控维管形成层干细胞的增殖。尽管近年来关于赤霉素与生长素协同调控木材的形成已取得了重大进展,但具体的调控分子机制仍待进一步阐明。杨属(Populus trichocarpa)植物作为林业研究的模式物种,其茎干生长具有完整的次生生长发育过程,为形成层、木质部及韧皮部的分子调控探究提供了良好的材料。随着毛果杨基因组测序的完成及其稳定遗传转化再生体系的建立,极大地促进了在细胞及分子水平上对次生生长的调控探究。本论文利用细胞学及遗传学等实验手段,重点分析内源改变赤霉素水平对维管形成层分裂活性的影响,解析这一调控作用与生长素之间的关联性,初步阐明两者之间协同调控维管形成层活性的分子机制。主要研究结果如下:(1)内源上调赤霉素水平促进维管形成层的细胞分裂将拟南芥中已报道的调控赤霉素生物合成的关键酶基因GA3ox与毛果杨基因组中所有的GA3ox基因构建进化树,结合组织表达模式分析,筛选出在茎中高表达的PtrGA3ox1作为目标基因,构建超表达载体并转化毛白杨,成功获得转基因株系。与野生型相比,超表达PtrGA3ox1植株茎干中赤霉素含量显著上升,株高增加、茎干增粗。切片观察发现,维管形成层的区域范围显著变宽,形成层细胞层数显著增加,木质部细胞层数略有增加,导管显著增大。荧光定量PCR显示,与野生型相比,PtrGA3ox1过表达植株中维管干细胞分裂调控的标记基因WOX4、ANT、CYCD3:3等表达水平均显著上调,进一步证实了细胞学切片的结果。以上结果表明:赤霉素正向调控木本植物维管形成层的分裂与分化。GC-MS检测结果表明,与野生型相比,过表达PtrGA3ox1植株茎干中生长素的水平显著增加,暗示赤霉素介导的维管形成层的分裂活性与生长素具有相关性。(2)赤霉素介导的维管形成层的分裂调控部分依赖生长素的信号传导为搞清赤霉素对维管形成层活性的调控是否依赖于生长素的信号传导,构建点突变的Aux/IAA蛋白IAA9的超表达载体(IAA9m),转入赤霉素上调的转基因材料,成功获得恢复株系。形态学分析发现,与赤霉素上调的转基因株系相比,恢复株系显著降低了植株的生长高度及茎干的直径,但仍高于野生型。细胞学切片及甲苯胺蓝染色观察发现,恢复株系中形成层的区域范围及细胞层数均显著降低,但仍高于野生型,对木质部层数及导管大小的定量统计显示,与形成层的变化趋势相一致。以上实验结果表明,赤霉素正向调控维管形成层的分裂部分依赖生长素的信号传导。(3)赤霉素影响生长素的极性运输为阐明赤霉素与生长素互作的调控机制,本论文定量检测了维持生长素稳态相关的基因的表达量,包括合成、降解及转运。结果表明,与野生型相比,生长素转运蛋白基因PIN的表达在转基因株系中显著上调。毛果杨中包含15个PIN基因,利用RNA-Seq数据分析所有PIN基因在茎中的表达模式,筛选得到在形成层区域高表达的PIN1基因,推测其在茎中对生长素的转运发挥关键作用。烟草瞬时转化实验证明PIN1蛋白定位于质膜上。将PtrGA3ox1过表达载体转入PIN1基因荧光报告株系中,结果发现,与对照组相比,赤霉素扩大PIN1蛋白在形成层的分布范围,增强PIN1蛋白的荧光信号强度。以上结果说明,赤霉素正向调控生长素转运蛋白PIN的转录水平表达,扩大其分布范围,影响生长素的转运。(4)生长素转运蛋白PIN对维管形成层分裂活性的调控构建PIN1a的超表达及干扰载体,转入毛白杨,获得转基因株系。通过细胞学切片分析发现,与野生型相比,PIN1a的超表达株系维管形成层区域变大,细胞层数显著增多,这一表型与赤霉素含量上调所产生的表型相一致。在PIN1的干扰株系中,维管形成层范围变窄,细胞层数明显减少。上述结果说明生长素转运蛋白的变化影响维管形成层的分裂活性。综上所述,赤霉素含量的变化影响维管形成层的分裂活性。生长素信号的阻断部分恢复了赤霉素上调介导的维管形成层的分裂活性变化。赤霉素通过调控生长素转运蛋白的转录水平的表达及分布范围调控生长素的转运,介导与生长素的互作协同调控维管形成层的分裂活性。