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目的:蛇六谷为天南星科魔芋属多年生草本植物的块茎,为中医临床常用的抗肿瘤中药,其主要有效成分葡甘露聚糖(KGM)的含量约占蛇六谷50%～60%,课题组前期研究发现,KGM能提高巨噬细胞的吞噬能力,促进细胞因子的释放,提高机体的免疫能力,具有明确的免疫抗肿瘤作用。巨噬细胞的极化是发挥免疫功能抗肿瘤的主要环节,靶向抑制M2型巨噬细胞分化、清除M2型巨噬细胞等措施已成为肿瘤治疗研究的重要领域之一,KGM免疫抗肿瘤作用是否通过影响巨噬细胞M1/M2亚型来发挥免疫调节作用尚未有相关报道。本研究拟以巨噬细胞株RAW264.7为研究对象,建立M1/M2亚型巨噬细胞极化模型,探讨KGM对巨噬细胞极化的调节作用,以及可能的相关信号通路,以期为KGM免疫抗肿瘤的相关药物研究提供科学依据。方法:(1)巨噬细胞株RAW264.7体外培养,采用LPS(1μg/m L)+IFN-γ(20ng/m L)诱导RAW264.7极化为M1亚型巨噬细胞,流式细胞术检测膜表面蛋白CD16/32、CD206的阳性表达率,实时荧光定量PCR检测TNF-α、i NOS、IL-1β、IL-6、IL-12、Fizz1、Arg1和TGF-βm RNA的相对表达量,验证M1极化模型的成功。(2)KGM干预极化成功的M1亚型巨噬细胞,流式细胞术检测KGM对巨噬细胞膜表面分子CD86、CD206阳性表达率的影响,ELISA方法检测炎症因子TNF-α、IL-1β分泌的情况,Griess法检测一氧化氮释放量,q RT-PCR方法考察KGM对M1亚型巨噬细胞相关细胞因子m RNA作用的影响,Western blotting法检测KGM对M1亚型巨噬细胞NF-κB通路TLR4、Myd88、IKKα、P-IκBα、NF-κB P65和P-NF-κB p65蛋白表达的影响。(3)采用IL-4(20 ng/m L)诱导RAW264.7极化为M2亚型巨噬细胞,流式细胞术检测CD206和CD16/32的阳性表达率,q RT-PCR检测TNF-α、i NOS、IL-1β、Fizz1、Arg1和TGF-βm RNA等因子的相对表达量,验证M2极化模型的成功。(4)KGM干预极化成功的M2亚型巨噬细胞,流式细胞术检测KGM对巨噬细胞膜表面分子CD86、CD206的影响,ELISA方法检测IL-10和TGF-β炎症因子分泌的情况,q RT-PCR检测KGM对M2亚型巨噬细胞相关细胞因子m RNA的表达量,Western blotting法检测KGM对M2亚型巨噬细胞JAK-STAT6通路IL-4Rα、STAT6、P-STAT6、SOCS1、KLF4、PPARγ和PPARδ蛋白表达的影响。结果:(1)LPS(1μg/m L)+IFN-γ(20 ng/m L)可以有效地诱导巨噬细胞株RAW264.7极化为M1亚型巨噬细胞。经检测M1亚型特异性膜表面分子CD16/32的阳性表达率由46.58%上升到71.89%,M2亚型特异性膜表面分子CD206阳性表达率由10.65%下降到8.59%,均具有显著性差异(P<0.01);与对照组相比,M1亚型巨噬细胞特异性标志物IL-6、IL-12、IL-1β、i NOS和TNF-αm RNA表达量升高(P<0.05),M2亚型巨噬细胞特异性标志物Fizz1和Arg1 m RNA表达量降低(P<0.01),验证了巨噬细胞M1亚型极化成功。(2)不同剂量的KGM干预极化成功的M1亚型巨噬细胞,与模型组比较,100μg/m L KGM能进一步升高M1亚型膜表面分子标志物CD86的表达,CD86的阳性表达率由59.87%上升到72.95%(P<0.01),降低了M2亚型膜表面分子标志物CD206的表达,CD206的阳性表达率由10.40%下降到3.53%(P<0.01);Griess结果显示,KGM能明显升高NO的表达,与模型组比较,有统计学差异(P<0.01);ELISA结果显示,与模型组比较,KGM能够进一步诱导TNF-α和IL-1β的表达与释放(P<0.01);q RT-PCR结果表明100μg/m L KGM能有效的增加M1型巨噬细胞标志性细胞因子TNF-α、i NOS、IL-6、IL-1β和IL-12 m RNA的表达(P<0.01),降低M2型巨噬细胞标志性细胞因子Fizz1与Arg1 m RNA的表达(P<0.01),初步表明KGM能增强M1亚型巨噬细胞的活性,诱导M2亚型巨噬细胞向M1型转变。Western blotting结果显示LPS与IFN-γ激活TLR4/Myd88信号转导介导的NF-κB途径,经KGM干预后,100μg/m L KGM能促进NF-κB通路相关蛋白IKKα和P-IκBα蛋白的表达(P<0.01),促进NF-κB从胞浆游离出来转运到细胞核内,能有效激活TLR4/Myd88信号转导介导的NF-κB途径。(3)IL-4(20 ng/m L)可以有效地诱导RAW264.7极化为M2亚型巨噬细胞。M2亚型特异性膜表面分子CD206阳性表达率由7.19%上升到48.62%(P<0.01),M1亚型特异性膜表面分子CD16/32的阳性表达率由40.87%下降到28.31%(P<0.01);M2亚型巨噬细胞特异性标志物Arg1、TGF-β、Fizz1 m RNA的表达升高(P<0.05),M1亚型巨噬细胞特异性标志物TNF-α、i NOS和IL-12 m RNA的表达降低(P<0.05),验证M2亚型巨噬细胞极化成功。(4)不同剂量的KGM干预极化成功的M2亚型巨噬细胞,与模型组比较,100μg/m L KGM降低M2亚型膜表面分子标志物CD206的表达,CD206的阳性表达率由33.04%下降到14.97%(P<0.01),升高了M1亚型膜表面分子标志物CD86的表达,CD86的阳性表达率由39.63%上升到55.46%(P<0.01);ELISA结果显示,KGM降低了细胞因子IL-10和TGF-β的表达与释放,与模型组比较,均具有显著性差异(P<0.01);q RT-PCR结果表明,相比较于模型组,KGM组能有效的增加M1型巨噬细胞标志性细胞因子TNF-α、i NOS和IL-6 m RNA的表达(P<0.01),降低M2型巨噬细胞标志性细胞因子Fizz1 m RNA的表达(P<0.01),进一步证明KGM能增强M1亚型巨噬细胞的活性,诱导M2型向M1型转化;Western blotting结果显示IL-4通过JAK-STAT6通路诱导M2型巨噬细胞的活化,KGM抑制了这一进程,降低了JAK-STAT6信号通路相关蛋白IL-4Rα、SOCS1、P-STAT6、KLF4、PPARγ和PPARδ的表达,差异均具有统计学意义(P<0.01),JAK-STAT6可能是KGM抑制M2亚型巨噬细胞活化的潜在机制。结论:KGM对活化的小鼠巨噬细胞RAW264.7的M1和M2亚型均具有免疫调节作用,能够进一步促进M1亚型巨噬细胞的活化,抑制M2亚型巨噬细胞的活化,增强M1亚型巨噬细胞的免疫调节功能,促进M2亚型巨噬细胞向M1表型转变。KGM调节M1亚型巨噬细胞的潜在机制可能为TLR/Myd88/NF-κB途径,JAK-STAT6途径可能参与KGM调节M2亚型巨噬细胞的免疫抑制作用。