目的:蛋白质的泛素化参与了细胞重要过程蛋白质的翻译后修饰,泛素特异性蛋白酶47(ubiquitin specific proteases 47,USP47)是一种具有将底物去泛素化功能的半胱氨酸蛋白酶,属于去泛素化酶(deubiquitinases,DUBs)家族一员。该研究主要探究USP47在放射性皮肤损伤中的作用及其机制。方法:(一)研究USP47对放射性皮肤损伤进展的影响:1、对USP47基因敲除小鼠进行鉴定繁育,追踪统计其生长时期的体重,从而评估敲除USP47基因对小鼠生长发育和繁殖的影响;2、使用USP47敲除小鼠建立放射性皮肤损伤模型,通过伤口评分统计,拍摄伤口照片和组织苏木素染色等实验评估小鼠皮肤损伤情况。(二)细胞水平探索USP47对放射性皮肤损伤进展的影响:1、通过免疫荧光实验和Western blot检测皮肤细胞在受到照射后其USP47蛋白的表达和定位情况;2、合成包装USP47基因敲除慢病毒并感染皮肤细胞,通过Western blot和荧光定量PCR来验证慢病毒的敲除效果;3、通过CCK-8和EdU实验探究USP47基因敲除对受照皮肤细胞增殖能力的影响;4、通过流式细胞术检测凋亡来探究USP47基因敲除后对受照皮肤细胞凋亡率的影响;5、通过划痕实验探究USP47基因敲除后对皮肤细胞迁移能力的影响;6、利用流式细胞术检测细胞周期探究USP47基因敲除后对受照细胞周期其分布的影响。(三)利用高通量蛋白质组学对放射性皮肤损伤的小鼠皮肤组织进行分析,研究USP47基因敲除小鼠与野生小鼠照射后蛋白质发生的差异,探究USP47在皮肤组织中所影响的蛋白质功能变化。结果:(一)USP47基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,生长发育没有显著差异,繁殖水平有所下降。(二)利用USP47基因敲除小鼠建立的放射性损伤模型,与野生小鼠相比,USP47基因敲除小鼠的皮肤损伤严重,愈合较慢。(三)USP47基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,受照后的皮肤组织皮肤附属器和表皮厚度没有显著差异,免疫组化染色未能显色。(四)免疫荧光和Western blot结果显示USP47定位在核内,USP47蛋白表达水平会随剂量增加而增高,随时间发生改变。(五)USP47基因敲除的皮肤细胞在受照后的增殖能力降低,迁移能力下降。(六)USP47基因敲除的皮肤细胞在受照后的凋亡率增高,细胞周期阻滞(七)通过蛋白组学,定量出了 3251个差异蛋白,其中上调超过1.5倍的有63个,下调1.5倍的有170个。(八)生物信息学分析发现,差异表达蛋白主要富集在细胞胞外区域、细胞核与细胞质等部位,主要参与的几个生物学过程包括翻译后修饰,蛋白质更新,分子伴侣和防御机制等方面。而其主要参与的排名比较靠前的信号通路是补体和凝血级联信号通路、朊病毒病信号通路、视黄醇代谢信号通路及铁死亡信号通路等。结论:泛素特异性蛋白酶47(USP47)参与了放射性皮肤损伤的进展,USP47的缺失将会导致小鼠皮肤受照射后损伤会更严重,USP47沉默的皮肤细胞在照射后也会有不同程度的负面影响。USP47有望作为放射性皮肤损伤的防治新靶点。