第一部分蓓萨罗丁对小鼠创伤性脑损伤后神经功能恢复的作用目的:评估蓓萨罗丁对小鼠创伤性颅脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)后神经功能恢复的影响,探讨蓓萨罗丁治疗TBI的可能性。方法:实验一:蓓萨罗丁对小鼠TBI后神经功能恢复的影响雄性、12周龄、体重20-22克的C57BL/6小鼠90只按随机数字表分为以下几组:假手术组(n=30),溶剂对照组(n=30),蓓萨罗丁组(n=30)。在TBI-0310颅脑创伤仪上按如下参数建立控制性皮质损伤模型来模拟TBI,参数为:撞击速度5 m/s,撞击探头直径3 mm,接触时间100 ms,撞击深度2 mm。蓓萨罗丁组和溶剂对照组接受TBI打击,假手术组不接受打击。在术后两小时和术后每天,蓓萨罗丁组按5mg/kg/day剂量给予蓓萨罗丁,溶剂对照组则给予等量的溶剂,假手术组不给予任何药物或溶剂处理。在伤前、伤后第1、3、7、14天通过神经功能缺失程度评分(Neurological severity score,NSS)、抓线测试、转棒测试对小鼠的神经功能进行评估。在TBI后15-19天,通过莫里斯水迷宫实验检测小鼠的学习能力和空间记忆功能。实验二:蓓萨罗丁对小鼠TBI伤灶周围炎症水平的影响在TBI后第1、3、7天,取小鼠TBI伤灶周围的脑组织约10mg提取蛋白,用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测组织中的炎症因子白细胞介素-1b(Interleukin 1b,IL-1b)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)的含量。在TBI后第7天,经心脏灌注后取各组小鼠大脑进行冰冻切片,再行免疫荧光染色检测脑切片中小胶质细胞标记物Iba-1的表达达情况。实验三:蓓萨罗丁对小鼠TBI伤灶周围细胞凋亡水平的影响在TBI后第1、3、7天,取小鼠TBI伤灶周围的脑组织约50mg提取蛋白,用蛋白印记法检测组织中活化的凋亡蛋白酶3的含量。在TBI后第7天,经心脏灌注后取各组小鼠大脑制作石蜡切片和冰冻切片,用石蜡切片行TUNEL染色检测切片中组织细胞的DNA断裂情况,以此反映凋亡情况,再用冰冻切片行免疫荧光染色检测脑切片中活化凋亡蛋白酶3的表达达情况。实验四:蓓萨罗丁对小鼠的副作用检测在完成所有的功能学实验检测后,首先称取小鼠体重,再用抗凝管取小鼠的静脉血并离心获取血浆,用试剂盒检测血浆甘油三酯浓度。再将小鼠断头处死,取出肝脏称重,计算肝脏重量与体重的比值,最后用肝脏制作石蜡切片并进行HE染色,显微镜下观察肝脏显微结构有无改变。结果:实验一:在TBI后3天、7天、14天,与溶剂对照组相比,蓓萨罗丁组小鼠的NSS评分显著降低,差异有显著性(P<0.05),提示蓓萨罗丁显著改善小鼠的神经功能。在TBI后1天,与溶剂对照组相比,蓓萨罗丁组小鼠的抓线成绩显著升高,差异有显著性(P<0.05),提示蓓萨罗丁显著改善小鼠的抓线能力。在TBI后1天、3天、7天、14天,与溶剂对照组相比,蓓萨罗丁组小鼠的转棒停留时间明显延长,差异有显著性(P<0.05),提示蓓萨罗丁显著改善小鼠的平衡运动功能。在TBI后15至19天,与溶剂对照组相比,蓓萨罗丁组小鼠找到隐藏平台所用时间并未显著缩短(P>0.05),提示蓓萨罗丁并未显著改善小鼠TBI伤后的学习能力。在TBI后第20天,与溶剂对照组相比,蓓萨罗丁显著增加了小鼠在原平台象限的停留时间和路程(P<0.05),表明蓓萨罗丁改善了小鼠TBI后的空间记忆功能。实验二:在TBI后,蓓萨罗丁组小鼠伤灶周围脑组织中的IL-1b、IL-6、TNF-α浓度也都显著上升,IL-1b和IL-6的浓度均在TBI后1天达最高值,TNF-α浓度在TBI后第3天达最高值。在TBI后第7天,蓓萨罗丁组小鼠的IL-1b和IL-6浓度均低于溶剂对照组,差异具有显著性(P<0.05);在TBI后第1天和第7天,蓓萨罗丁组小鼠的TNF-α浓度显著低于溶剂对照组(P<0.05),这些结果表明蓓萨罗丁的治疗显著降低炎症因子水平。与假手术组相比,溶剂对照组和蓓萨罗丁组小鼠伤灶周围脑组织中小胶质细胞数量均明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。与溶剂对照组小鼠相比,蓓萨罗丁组小鼠伤灶周围脑组织中小胶质细胞数量显著降低(P<0.05),表明蓓萨罗丁显著抑制TBI后小胶质细胞在伤灶周围的聚集。实验三:溶剂对照组和蓓萨罗丁组小鼠伤灶周围脑组织中活化的凋亡蛋白酶-3的水平均在TBI以后第1天达到最高值,而后逐渐下降,均在伤后第7天最低。蓓萨罗丁组小鼠伤灶周围脑组织中活化的凋亡蛋白酶-3的水平在TBI后第1、3、7天均显著低于溶剂对照组水平,差异有统计学意义(P<0.05)。在用免疫荧光检测该蛋白酶水平时发现,与假手术组相比,溶剂对照组和蓓萨罗丁组小鼠伤灶周围脑组织中活化的凋亡蛋白酶-3的水平均在TBI后第7天显著升高(P<0.05)。蓓萨罗丁组小鼠伤灶周围脑组织中活化的凋亡蛋白酶-3的水平在TBI后第7天显著低于溶剂对照组的水平,差异有统计学意义(P<0.05)。与溶剂对照组相比,蓓萨罗丁组小鼠伤灶周围Tunel染色阳性细胞明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),表明蓓萨罗丁显著降低TBI后小鼠伤灶周围脑组织中的细胞凋亡水平。实验四:与溶剂对照组和假手术组相比,蓓萨罗丁组的血浆甘油三酯浓度并未显著升高(P>0.05),而且小鼠肝脏重量也未显著改变(P>0.05)。在本实验中的假手术组、溶剂对照组和蓓萨罗丁组均可观察到大量形态正常的肝小叶,且在蓓萨罗丁组并未观察到肝脏结构的紊乱,也没有观察到假小叶形成。这些结果表明连续21天以“5mg/kg/day”的剂量给予蓓萨罗丁并未引起显著的副作用。结论:低剂量的蓓萨罗丁显著减轻小鼠TBI后伤灶周围脑组织中的炎症反应,抑制细胞凋亡,最终显著促进TBI后小鼠神经功能的恢复,且并不产生毒副作用。第二部分长链非编码RNA Neat1在蓓萨罗丁的神经保护效应中所发挥的作用目的:从非编码RNA的角度研究蓓萨罗丁发挥神经保护作用的机制方法:实验一:蓓萨罗丁对细胞的最佳治疗剂量以及其对各亚型RXR受体的影响培养小鼠海马神经元HT22细胞株,用以下浓度梯度的蓓萨罗丁溶液处理细胞:0.1μM,0.3μM,0.9μM,2.7μM,8.1μM和24.3μM,再将细胞予以氧糖剥夺(Oxygen glucose deprivation,OGD)刺激,用MTT法检测细胞活力,观察不同浓度的蓓萨罗丁在正常和OGD情况下对细胞活力的影响,筛选出蓓萨罗丁处理细胞的最佳浓度,再用此浓度处理HT22细胞后提取总蛋白,用ELISA法检测RXR各亚型的表达情况。再经腹腔注射给予C57BL/6小鼠低浓度的蓓萨罗丁处理,并提取大脑皮层蛋白用于检测RXR各亚型的表达情况。实验二:RXR-α与Neat1基因启动子的结合情况首先用生物信息学技术分析在Neat1基因启动子区的潜在RXR-α结合位点。再用甲醛处理HT22细胞使之形成蛋白交链,清洗后加入蛋白裂解液并提取纯化的蛋白,再将其置于RXR-α共沉淀系统中处理,用经RXR-α沉淀下来的混合物来提取DNA,最后用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)来验证该共沉淀产物中是否存在Neat1基因启动子的DNA片段。再将PCR的扩增产物经由凝胶电泳验证目的DNA片段的真实性。实验三:RXR-α与Neat1基因启动子结合后是否对Neat1基因的转录产生影响用双荧光素酶报告基因检测系统来验证RXR-α与Neat1启动子结合后会影响启动子活力,首先构建pc DNA3.1(+)-RXR-α质粒和p GL3-Basic-Neat1-promoter质粒,将它们都共同转化至目的细胞中,以海肾萤光素酶载体作为对照,再通过检测荧光强度来分析萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性,以此判断RXR-α是否影响了Neat1启动子的活性。用蓓萨罗丁处理HT22细胞并提取其总RNA,用PCR检测Neat1基因的长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)转录产物在经蓓萨罗丁处理后如何变化。再用蓓萨罗丁处理小鼠并提取其大脑皮层的总RNA,检测Neat1lnc RNA的变化情况。另外,检测在OGD处理后的HT22细胞中以及在遭受TBI打击后的小鼠大脑皮层中的Neat1lnc RNA的变化情况。实验四:与Neat1lnc RNA直接结合的蛋白首先用PCR的方法制成Neat1lnc RNA的全长链探针,再提取在正常条件和OGD条件下的HT22细胞的总蛋白,将总蛋白与Neat1lnc RNA探针孵育,再用RNA-pulldown技术收集被Neat1lnc RNA捕获的蛋白。将捕获的蛋白经凝胶电泳分离,切取目的条带进行飞行质谱检测,以确定蛋白的种类和相对丰度。用蛋白印迹的方法验证目的蛋白质谱结果。实验五:Neat1对细胞炎症和凋亡的影响以及PIDD1蛋白在其中所扮演的角色首先构建沉默Neat1基因、沉默PIDD1基因以及过表达Neat1基因的腺病毒,再用它们分别感染HT22细胞和BV2细胞。用OGD处理HT22细胞诱导细胞凋亡,观察在不同的Neat1lnc RNA和PIDD1表达水平下细胞凋亡率的变化情况。用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激BV2细胞诱发炎症反应,观察在不同的Neat1lnc RNA和PIDD1表达水平下炎症水平的变化情况。实验六:Neat1lnc RNA对C57BL/6小鼠TBI后伤灶周围炎症、凋亡以及神经功能恢复的影响首先经侧脑室分别注射Neat1基因沉默腺病毒或Neat1基因过表达腺病毒,用PCR法检测它们对脑组织中Neat1lnc RNA的干扰效率,再用这些小鼠制作TBI模型。用ELISA法检测伤灶周围炎症因子IL-1b、TNF-α的含量,用TUNEL法联合蛋白印迹法检测伤灶周围细胞凋亡水平。再进行NSS测评、旋转木实验、抓线实验和水迷宫实验,评估小鼠运动功能、学习功能以及空间记忆功能。结果:实验一:当蓓萨罗丁浓度小于8.1μM时,对HT22细胞活力不产生显著的伤害性作用(P>0.05),但当其浓度大于24.3μM时,则显著降低HT22细胞活力(P<0.05)。当细胞处于氧糖剥夺的环境时,细胞活力显著降低甚至凋亡,本研究发现2.7μM和8.1μM的蓓萨罗丁均能显著改善氧糖剥夺环境中的细胞活力(P<0.05),而8.1μM的效果最佳(P<0.05)。本研究发现在给予8.1μM蓓萨罗丁持续治疗HT22细胞4天后,仅RXR-α蛋白含量显著增加(P<0.01),而RXR-β和RXR-γ蛋白含量并未受到显著影响(P>0.05)。在以5 mg/kg/day的剂量连续治疗C57BL/6小鼠4天后,小鼠皮层脑组织中RXR-α蛋白含量显著增加(P<0.01),而RXR-β和RXR-γ蛋白含量并未显著改变(P>0.05)。以上结果表明受蓓萨罗丁影响最明显的亚型是RXR-α。实验二:通过生物信息学分析发现,在Neat1基因的启动子区域存在两个潜在的RXR-α结合位点。通过共沉淀和后续的PCR检测发现,在RXR-α蛋白所钓取的DNA片段中检测到有Neat1基因启动子结合位点1(chr19:5,845,979-5,846,077,TGACGTCA),但是没有检测到结合位点2(chr19:5,845,482-5,845,593,TATAAA),且进一步的凝胶电泳实验结果证实了前一步PCR检测结果的正确性。但在Ig G所钓取的DNA中未检测到Neat1结合位点。以上结果表明,在Neat1基因的启动子区存在RXR-α的结合位点,结合序列为TGACGTCA,在染色体上的位置为chr19:5,845,979-5,846,077。实验三:在转化了p GL3-basic空载体和pc DNA3.1空载体的HT22细胞中萤火虫荧光素酶活性(1±0.2)极低;在转化了p GL3-basic空载体和RXR-α基因重组质粒的HT22细胞中萤火虫荧光素酶活性(0.35±0.02)也非常低。但是在转化了Neat1启动子质粒和pc DNA3.1空载体的细胞中萤火虫荧光素酶活性(298.77±75.54)较高;在转化了Neat1启动子质粒和RXR-α基因重组质粒的细胞中萤火虫荧光素酶活性(814.20±55.59)极高。而且,同时转化了Neat1启动子质粒和RXR-α基因重组质粒的细胞其萤火虫荧光素酶的活性显著强于其余各组(P<0.05),表明RXR-α显著增强Neat1基因启动子的活性。在正常培养条件下,蓓萨罗丁(8.1μM)连续治疗HT22细胞4天后其Neat1 lnc RNA水平显著上调(P<0.05)。当HT22细胞处于糖氧剥夺条件下时,Neat1 lnc RNA水平显著上调(P<0.05),而且在此条件下给予蓓萨罗丁治疗会进一步显著提高Neat1 lnc RNA水平(P<0.05)。连续4天给予正常C57BL/6小鼠蓓萨罗丁(5 mg/kg/day)治疗后,显著增加了小鼠大脑皮层中的Neat1 lnc RNA含量(P<0.05)。当小鼠遭受TBI打击后,其伤灶周围大脑皮层中的Neat1 lnc RNA水平显著上调(P<0.05),此外,在此条件下给予小鼠蓓萨罗丁治疗会进一步增加伤灶周围皮层中的Neat1 lnc RNA含量(P<0.05)。实验四:将共沉淀的蛋白经凝胶电泳后,切取了4个差异性条带进行质谱检测,共发现20种非旁斑蛋白能与Neat1lnc RNA直接结合,这其中就包括了PIDD1这一与凋亡和炎症密切相关的蛋白。实验五:PIDD1基因沉默显著抑制了LPS所诱导的炎症因子产生(P<0.05),表明PIDD1基因具有促进炎症的功能。Neat1基因沉默可进一步促进LPS所诱导的炎症因子大量产生(P<0.05),但Neat1基因过表达则显著抑制其产生(P<0.05),这表明Neat1基因具有显著的炎症抑制作用。此外,在Neat1基因沉默的情况下同时沉默PIDD1基因,可显著抑制Neat1基因沉默所引起的促炎症因子产生作用(P<0.05)。OGD刺激引起了明显的HT22细胞凋亡(P<0.01),但Neat1基因过表达可以显著减轻OGD所导致的细胞凋亡(P<0.05),而Neat1基因沉默可以进一步加重细胞凋亡(P<0.05),这表明Neat1基因具有抗凋亡作用。我们的研究也发现,PIDD1基因下调显著抑制了细胞凋亡,这也表明PIDD1基因具有促凋亡作用(P<0.05)。另外,在Neat1基因沉默的情况下同时沉默PIDD1基因,可显著抑制Neat1基因沉默所引起的促凋亡作用(P<0.05)。实验六:经侧脑室注射的腺病毒显著地改变了脑组织中Neat1lnc RNA水平(P<0.05)。Neat1基因过表达显著减少了TBI伤灶周围脑组织中炎症因子的含量并降低细胞凋亡水平(P<0.05),而Neat1基因沉默则显著增加了TBI伤灶周围脑组织中炎症因子的含量并提高了细胞凋亡水平(P<0.05)。此外,Neat1基因过表达显著促进了小鼠TBI后的运动功能和空间记忆功能的恢复(P<0.05),而Neat1基因沉默则阻碍了小鼠运动功能和空间记忆功能的恢复(P<0.05)。结论:蓓萨罗丁对小鼠TBI后的神经保护作用与Neat1lnc RNA密切相关。