一、研究背景及目的大脑多巴胺神经营养因子(Cerebral Dopamine Neurotrophic Factor, CDNF),是一种新发现的进化保守的蛋白,在大鼠帕金森病动物模型中,大脑多巴胺神经营养因子CDNF是一种潜在的能够保护和恢复多巴胺能神经元的功能的关键治疗蛋白。CDNF在包括大脑皮层,海马,黑质,纹状体和中脑等多个脑区的神经元中广泛表达。人的CDNF可以糖基化,并从瞬时转染细胞中分泌,然而,目前CDNF分泌的调控机制还不清楚。作为一个新发现的神经营养因子,关于CDNF运输和分泌的一些基本问题还没有解决。首先,CDNF是怎么分泌的,是通过组成型分泌途径还是调节型分泌途径?主要通过哪条途径?第二,CDNF蛋白合成中发生什么类型的糖基化?N-连接的糖基化还是O-连接的糖基化?糖基化是否影响CDNF蛋白的运输和分泌?最后,人们已经知道人的CDNF没有前原序列,但是在CDNF蛋白中是否存在能够影响胞内运输和分泌的一些结构域。二、实验方法1.各种表达质粒的构建2.测定过表达的CDNF在PC12及HEK293细胞中的分泌3. CDNF在大鼠海马神经元及PC12细胞中的免疫荧光细胞化学染色4.利用alanine-scanning技术,寻找关键氨基酸5.在PC12细胞中各种突变体与内质网和高尔基体标志物的共定位检测6.COS-7细胞中CDNF的运输情况检测7.在PC12细胞中各突变体与分泌囊泡标志物的共定位检测三、实验结果1、CDNF在神经分泌型细胞中的分布与分泌情况为了检测CDNF在细胞中的定位和分布情况,我们构建了带有C-末端HA标签的人类CDNF cDNA的真核表达质粒(pcDNA3.1-HA-hCDNF)。然后通过Western Blot方法,证实CDNF即通过组成型分泌途径又通过调节型分泌途径,并且主要通过调节型分泌途径分泌。利用HA标签免疫荧光化学染色方法,我们发现CDNF在海马神经元和分化的PC12细胞的胞体和突起中均有点状分布。2、证实CDNF的糖基化不影响它的分泌我们构建了影响CDNF的N-连接糖基化和O-连接糖基化的点突变的突变体：N57A(57位N-连接糖基化位点N突变为A)和T181A(181位O-连接糖基化位点T突变为A),通过Western Blot的方法证明在HEK293细胞中破坏CDNF的N-连接糖基化,不影响CDNF的组成型分泌。随后,我们发现在PC12细胞中不发生CDNF的N-连接糖基化,因此我们构建了抑制O-连接糖基化的突变体T181A,并证明破坏CDNF在PC12细胞中的O-连接糖基化不影响CDNF的分泌。3、探索CDNF中调控其分泌的关键区域通过在α-Helix中插入脯氨酸破坏α-Helix结构,我们构建了一系列CDNF的突变体。通过Western Blot的方法证明,破坏第一个α-Helix (M1)会影响CDNF的组成型和调节型分泌,然而,破坏第七个α-Helix (M7)只影响CDNF的调节型分泌。其它突变体不影响CDNF的分泌。利用免疫荧光细胞化学染色方法,发现M1在分化的PC12细胞中的分布出现异常(M1更多聚集在胞体而很少在突起分布),但是,跟Wt相比M7的分布无明显变化。为了排除插入脯氨酸对蛋白的整体空间结构的影响,我们利用alanine-scanning技术构建一系列突变体,发现41-48氨基酸序列在CDNF的分泌中发挥重要作用。4, CDNF分泌运输缺陷的关键步骤鉴定利用免疫荧光细胞化学染色方法,我们发现M7与Wt与内质网标志物共定位情况无明显区别。与Wt和M7相比,M1与内质网标志物calnexin有更多的共定位,然而通过研究它们与高尔基体的标志物TGN38的共定位证实：跟Wt与M7相比,仅有很少部分的M1与TGN38共定位。为了进一步证实M1不能有效地从内质网运输到高尔基体,我们利用一种带荧光的温度敏感蛋白pEGFP-VSVG,在COS-7细胞中利用免疫荧光细胞化学染色方法发现,当温度从39.5℃C降到20℃C时,部分Wt-CDNF和M7聚集到高尔基体。但是跟Wt,M7和VSVG不同,在20℃C时M1不能有效聚集到高尔基体。5、M7不能有效地分选到调节型分泌途径我们推测M7的分泌异常可能是由于Golgi以后的运输出现了问题,因此检测了M7与一种分泌囊泡的标志物Secll的共定位,与Wt跟Secll的共定位不同,M1和M7跟Secll的共定位都很少。四、实验结论在PC12细胞中,CDNF主要通过调节型分泌途径分泌,CDNF的糖基化不影响它的分泌。并且发现影响CDNF分泌的两个关键区域：当破坏Helix-1,组成型分泌和调节型分泌都降低,并且Helix-1突变体在内质网聚集；当破坏Helix-7,组成型分泌不受影响只有调节型分泌减少。并且Helix-7突变体与分泌囊泡标志物的共定位减少。