背景:卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,死亡率高居妇科癌症首位,对女性健康及生命造成极大危害.手术是治疗卵巢癌的首要方法,但由于诊断卵巢癌的特异性及敏感性都不高,卵巢癌患者得到诊断时往往处于晚期,失去最佳手术时机,因此化疗在卵巢癌的治疗中发挥着举足轻重的作用。卵巢癌的一线化疗方案为PT(紫杉醇+铂类)化疗,由于最终肿瘤耐药及复发,晚期卵巢癌患者术后化疗的5年生存率小于30%。人们迫切寻找新的化疗药,并对化疗药耐药的机制进行探索。随着研究的深入,人们对紫杉醇耐药机制得到初步结果,最主要是由于肿瘤微管蛋白的改变及P-糖蛋白的过量表达等。天然细胞毒药物埃博霉素是一类作用于微管蛋白与微管的大环内酯类药物,是针对紫杉醇耐药问题而研发的新药。该类药物与紫杉烷类药物抗肿瘤机制相似,且抗各种肿瘤细胞系比紫杉烷类作用更强。由百时美施贵宝公司研发,于2007年10月经美国食品药品管理局(FDA)批准上市的伊沙匹隆成为首个代表埃博霉素类抗肿瘤药物的药品,当伊沙匹隆与微管蛋白结合时,促进微管蛋白聚合成微管并抑制其进行解聚,抑制细胞有丝分裂的进行,最终导致细胞凋亡。研究表明伊沙匹隆与紫杉醇作用机制相似且作用靶点相同,但对于由于微管蛋白改变导致的紫杉醇耐药却效果显著,且伊沙匹隆并非通过ATP依赖性跨膜转运泵P-糖蛋白(P-gp)进入细胞膜的,与紫杉醇耐药性形成互补;该药物在欧美上市后表现出强效抗癌活性,让人们在克服癌症的道路上再次看到希望。PI3K/AKT/m TOR信号通路在卵巢癌的发生发展中具有重大的作用,而其下游通路中的HIF-1α和VEGF在肿瘤的血管的生成、癌细胞的侵袭和转移中起着重要的作用。实验证明低浓度紫杉醇具有抗血管生成的作用,而伊沙匹隆在卵巢癌方面的凋亡及抗血管等作用鲜有报道。目的:伊沙匹隆及水飞蓟宾对卵巢癌细胞凋亡作用及对PI3K/AKT/m TOR通路及其下游HIF-1α、VEGF因子的影响。方法:1.体外培养卵巢癌SKOV3细胞株,模拟低氧环境,通过cck-8实验研究不同浓度的伊沙匹隆(1umol/L,5umol/L,10umol/L,20umol/L,50umol/L)及水飞蓟宾(100umol/L,200umol/L,400umol/L,600umol/L,800umol/L)单独及联合用药后对SKOV3细胞增殖的影响。2.体外培养卵巢癌SKOV3细胞株,模拟低氧环境,通过流式细胞技术检测伊沙匹隆和水飞蓟宾单独及联合用药后对卵巢癌细胞的凋亡作用。3.通过酶联免疫(ELISA)实验和RT-PCR实验检测伊沙匹隆和水飞蓟宾单独及联合用药后对胞外分泌因子VEGF的影响。4.通过蛋白质印迹法(Western Blot)实验,与PI3K、m TOR的抑制剂进行对比,检测伊沙匹隆和水飞蓟对PI3K/AKT/m TOR通路及HIF-1α因子的作用。结果:1.模拟低氧环境,用不同浓度的伊沙匹隆作用于对数期的SKOV3细胞24h后,应用CCK-8试剂处理检测,结果发现伊沙匹隆能够抑制SKOV3细胞的增殖,随着药物浓度的加大,抑制率明显提高,其IC50为9.84umol/L,水飞蓟宾在相对较高浓度范围内也可以抑制SKOV3细胞的增殖,其IC50为365.23umol/L,水飞蓟宾与伊沙匹隆联合作用后明显抑制细胞增殖作用。2.模拟低氧环境,用不同浓度的伊沙匹隆作用于对数期的SKOV3细胞24h后,运用流式细胞技术检测,结果发现伊沙匹隆及水飞蓟宾对SKOV3细胞的凋亡作用明显,水飞蓟宾与伊沙匹隆联合作用后对细胞凋亡抑制作用明显提升。3.模拟低氧环境,运用酶联免疫(ELISA)实验和RT-PCR实验检测发现不同浓度伊沙匹隆及水飞蓟宾抑制SKOV3细胞分泌的血管生长因子VEGF,两者联合作用后抑制了VEGF的生成及分泌。4.模拟低氧环境,不同浓度的伊沙匹隆和水飞蓟宾单独或联合作用于对数期的SKOV3细胞24h后,通过蛋白质印迹法(Western Blot)实验,与PI3K、m TOR的抑制剂进行对比,检测发现伊沙匹隆和水飞蓟宾对PI3K/AKT/m TOR通路及HIF-1α因子有抑制作用,且联合作用后效果显著。结论:1.在模拟低氧环境下,于一定浓度范围内,伊沙匹隆和水飞蓟宾可有效提高对SKOV3细胞的抑制率,并且随浓度的提升,抑制细胞增殖、促进凋亡的能力越强。同时,当伊沙匹隆与水飞蓟宾联合作用后,其抑制增殖及促进凋亡的作用效果明显增强。2.在模拟低氧环境下,伊沙匹隆和水飞蓟宾在一定浓度范围内能够使SKOV3细胞内PI3K/AKT/m TOR通路及其下游的HIF-1α、VEGF蛋白因子水平降低,并且二者联合作用后效果增强。表明伊沙匹隆除了具有杀伤癌细胞的作用,对血管生成过程的重要生长因子也有抑制作用。