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背景:结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病,当前全球结核病疫情严峻,耐药问题突出,深入探讨结核分枝杆菌的耐药对于结核病的防治尤为重要。研究表明当结核分枝杆菌受到不适宜环境刺激后,dev S-R双组份系统可以调控结核菌进入休眠状态,发生基因突变产生耐药。本实验组前期工作发现临床耐药菌株中休眠调节因子dev R表达增强,并且在蛋白分析中发现Dev R及其调控基因的蛋白表达水平增强。通过进一步的药物诱导实验,发现常用抗结核药物可以诱导dev R的表达升高,说明dev S-R双组份系统与结核分枝杆菌耐药关系密切。因此,我们设想在前期工作的基础上,建立结核分枝杆菌的休眠模型,探讨结核分枝杆菌休眠引起的耐药与hbh A表达的变化。方法:1.结核分枝杆菌体外休眠模型的建立及鉴定BCG野生株,经过“微氧+10%Dubos+p H5.0”环境37℃培养18天,分别取常规培养和第4、7、10、14和18天菌株测定600 nm下的吸光度(A)值绘制生长曲线,并进行金胺O-尼罗红双荧光染色和休眠相关基因hsp X、dev R等的表达量检测。2.休眠结核分枝杆菌的耐药性鉴定BCG菌株休眠培养,分别取常规培养和第4、7、10、14和18天菌株进行刃天青显色药敏检测。挑取耐药单克隆菌落提取其DNA,进行7种常见耐药相关基因(kat G、emb B、rps L、rpo B、gyr A、ahp C和inh A)测序。3.休眠结核分枝杆菌hbh A的表达分析BCG野生株和dev R缺失株分别经过常规培养和休眠培养,取常规培养和第4、7、10、14和18天菌株测定其生长曲线和进行金胺O-尼罗红双荧光染色比较。利用RT-PCR检测分析两种菌株hbh A基因的表达情况。结果:1.结核分枝杆菌体外休眠模型的建立及鉴定休眠培养过程中,BCG菌株的生长速度与常规培养菌株相比明显减慢(P<0.01);菌体抗酸性逐渐减弱,脂质累积逐渐增强;休眠相关基因hsp X、dev R表达量均出现上调,且培养第18天菌株明显高于常规培养菌株(P<0.05)。2.休眠结核分枝杆菌的耐药性鉴定刃天青显色药敏结果显示,结核分枝杆菌休眠培养的第18天异烟肼的MIC浓度是最初浓度的93.33倍;休眠培养的第18天利福平的MIC浓度是最初浓度的22.50倍。常见耐药相关基因测序均未出现突变。3.休眠结核分枝杆菌hbh A的表达分析BCG野生株和dev R缺失株经过休眠培养生长速度与常规培养相比均出现明显减慢(P<0.01)。荧光染色可以看出BCG野生株经过休眠培养,菌体逐渐进入休眠状态;而dev R缺失株经过培养菌体仍处于活化状态。BCG野生株在休眠条件培养过程中hbh A基因表达逐渐上调,且培养第18天菌株表达量明显高于常规培养菌株(P<0.05);dev R敲除株在休眠条件培养过程中hbh A基因表达逐渐下调,且培养第18天菌株表达量明显低于常规培养菌株(P<0.05)。除此之外,休眠培养第18天dev R敲除株(0.30±0.07)的hbh A表达量明显低于BCG野生株(1.86±0.25)。结论:本研究通过“微氧+10%Dubos+p H5.0”压力条件培养并检测休眠相关基因hsp X、dev R表达量确认BCG菌株休眠模型成功建立;进而证实BCG菌株休眠后在没有基因突变的情况下MIC浓度增加,出现表型耐药;通过RT-PCR检测BCG野生株与dev R敲除株hbh A基因表达情况,发现BC G野生株休眠后hbh A表达增强,而dev R敲除株表达减弱,证明了休眠与耐药及hbh A之间密切相关。