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[目的]端粒酶异常高表达与恶性肿瘤发生、发展及预后密切相关,而其催化亚单位(hTERT)是合成端粒酶全酶的限速因素。已有的研究表明,端粒酶的活性受到抑制后能够引起肿瘤细胞生长能力下降,并伴有细胞周期阻滞及细胞凋亡。目前一些学者认为端粒酶对肿瘤细胞生长的调节作用不仅与端粒酶能够维持端粒的稳定性有关,很可能也通过非端粒依赖的方式进行。近年来发展起来的RNA干扰技术由于其特异性和高效性而广泛应用于基因功能及肿瘤的基因治疗等方面研究,显示出巨大的应用前景。本研究设计并化学合成了针对hTERT的siRNA,通过其对hTERT表达的特异性抑制作用,观察对肿瘤细胞生长的影响及能否引起非端粒依赖性的细胞凋亡。并利用基因芯片技术检测与这种凋亡相关的基因表达变化及microRNA表达的变化。以期为深入理解hTERT的作用机理提供有价值的信息。[方法]设计并化学合成针对hTERT的siRNA,通过脂质体转染法将其导入HeLa细胞内,然后应用半定量RT-PCR、Western blotting、实时定量TRAP的方法检测hTERT-siRNA对hTERT表达的抑制效率及对端粒酶活性的抑制效率。然后通过软琼脂克隆形成实验及荷瘤裸鼠的siRNA肿瘤内注射的方法检验hTERT-siRNA能否抑制HeLa细胞的体外增殖能力及体内的生长能力。接着利用TUNEL原位凋亡检测的方法检验hTERT-siRNA能否诱导肿瘤细胞的凋亡。利用基因芯片检测hTERT-siRNA引起的基因表达及microRNA表达的变化。[结果]在第一部分中,半定量RT-PCR结果示,hTERT-siRNA组细胞hTERT mRNA的相对表达量为0.20,显著小于β-gal-siRNA组的0.73及LipofectAmine only组的0.78。Western blotting结果显示hTERT-siRNA组hTERT·myc融合蛋白的表达水平明显低于两个对照组。实时定量TRAP实验结果显示,hTERT-siRNA组端粒酶的活性仅为两个对照组的38%。以上实验结果说明所设计的hTERT-siRNA可以特异、有效地抑制HeLa细胞中hTERT的mRNA及蛋白表达水平,并降低端粒酶的活性。在第二部分中,软琼脂克隆形成实验结果显示,hTERT-siRNA组的克隆形成数量为1.00±1.00,明显小于β-gal-siRNA组的4.33±0.58和LipofectAmineonly组的4.00±1.00。荷瘤裸鼠肿瘤内注射siRNA治疗实验显示,实验结束时hTERT-siRNA组的肿瘤体积为940.12±244.2mm~3小于β-gal-siRNA组的2137.9±403.72mm~3和LipofectAmine only组的1896.92±291.23 mm~3,hTERT-siRNA组的肿瘤重量0.71±0.23g小于β-gal-siRNA组的1.46±0.32g和LipofectAmine only组的1.34±0.23g。说明hTERT-siRNA能够明显抑制的体外细胞增殖和体内肿瘤生长。在第三部分中,TUNEL原位凋亡检测显示转染后48小时,hTERT-siRNA组凋亡率为86.9%±3.5%,明显高于β-gal-siRNA组的2.6%±2.3%和LipofectAmine only组的9.0%±2.3%,提示hTERT-siRNA可以诱导某种非端粒依赖性的凋亡。基因芯片的结果显示hTERT-siRNA组和对照组之间有54个基因的表达差异大于4倍,其中16个与细胞的凋亡过程可能相关,应用半定量RT-PCR的方法验证了其中的6个。microRNA芯片筛选出18个在hTERT-siRNA组表达而β-gal-siRNA组未表达的microRNA,1个在β-gal-siRNA组表达而hTERT-siRNA组未表达的microRNA,其中let-7a-2、let-7a-3、let-7e、let-7i的变化可能与hTERT-siRNA诱导凋亡的表型变化相关。[结论]hTERT能够通过某种非端粒依赖性的方式抑制肿瘤细胞凋亡,hTERT特异性的siRNA可以促进肿瘤细胞凋亡,抑制其生长。通过cDNA芯片和microRNA芯片发现了一些与hTERT-siRNA诱导凋亡有关的基因及microRNA表达谱的变化,为进一步探索端粒酶的作用机制提供了线索。