研究背景与意义结直肠癌(colorectal cancer)是常见的消化道恶性肿瘤,世界每年新发病例102万,死亡约53万。90%以上的患者最终死于肿瘤转移,结直肠癌转移是导致结直肠癌患者低治愈率、高死亡率的主要原因,是结直肠癌防治的关键环节。阐明结直肠癌转移机制,干预和治疗转移是有效提高结直肠癌患者生存率和治愈率的重要措施。肿瘤细胞要完成转移过程,必须经历从原发瘤脱落、进入血管和／或淋巴管、在循环中生存、黏附于继发器官微血管、渗出血管和／或淋巴管、进入继发器官组织、形成微转移瘤并诱发血管发生,最终形成转移瘤。肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSC)是肿瘤内能够自我更新并能产生构成肿瘤全部细胞系的细胞亚群。针对CSC的起源和治疗策略研究已成为当今肿瘤研究热点。CSC的分化、增殖形成肿瘤,除了CSC自身的生物学特性以外,还依赖于肿瘤原发部位微环境和转移靶器官微环境。维持CSC不对称分裂、避免向终末细胞分化的微环境,称为“niche",包括微环境中的内皮细胞、成纤维细胞、炎症细胞、平滑肌细胞、神经细胞和脂肪细胞等支持细胞及它们所产生细胞因子。2003年Fidler修正的“种子与土壤”假说已经明确提出了转移瘤的形成是靶器官微环境相关因子与转移细胞协同作用的产物,抗转移治疗不仅要靶向阻断肿瘤细胞的高转移特性,而且应该对抗微环境中适应肿瘤细胞生长、血管发生、侵袭和转移的多种细胞与细胞因子。因此,干预播散“种子”和“土壤”(包括原发部位微环境和转移部位微环境)必须二者兼顾,才可能防止和对抗恶性肿瘤转移。本研究为CSC和微环境协同作用研究中的一个子课题。在前期的研究中我们应用单细胞源性细胞亚系筛选策略,发现了由单一细胞起源的细胞亚系,侵袭和转移潜能不同,转移相关分子标签预示结直肠癌转移的不良预后；细胞亚系高转移特性与CD133表达增强有关,提示结直肠癌CSC转移潜能的异质性。我们还分离和鉴定出结直肠癌系HT29、SW480、SW620和LoVo细胞系的CSC克隆,并已成功的获得了22例结直肠癌患者新鲜原发癌组织中的CSC克隆,通过裸鼠盲肠原位移植实验性转移模型,共获得了176个MCSC和非转移CSC(non-metastatic cancer stem cells, non-MCSC)。通过2D-质谱分析这两类克隆表达蛋白谱的差异,鉴定出CLIC4(chlorideintracellular channel protein4)等9种蛋白质表达与MCSC相关。前期用免疫组化检测了CLIC4在413例具有10年完整临床随访资料的结直肠癌患者原发癌组织中的表达情况,发现仅有少量癌细胞表达(与CSC占肿瘤细胞群的1/1000-1/100相一致)CLIC4,且CLIC4的表达水平与术后转移有关,不表达CLIC4的患者预后明显好于表达CLIC4患者。CLIC4调节肿瘤间质成纤维细胞转化为肌成纤维细胞,并且与肿瘤的进展有关,还通过调节肿瘤微环境促进肿瘤的侵袭和转移。肿瘤组织间质内成纤维细胞高表达CLIC4时,成纤维细胞胞浆内aSMA表达增高,细胞转分化为肌成纤维细胞,抑制卵巢癌间质成纤维细胞CLIC4的表达,肌成纤维细胞转分化率降低。将乳腺癌细胞与高表达CLIC4的成纤维细胞共同移植时,肿瘤细胞生长迅速。肿瘤生长过程中,间质内成纤维细胞、肌成纤维细胞及其所分泌的细胞因子是肿瘤局部微环境中的重要成分,癌细胞的外泌体(exosomes)中含有的TGFp可促进间质中肌成纤维细胞的转化,肌成纤维细胞分泌的细胞因子SDF-1能够诱导癌细胞的迁移。癌组织内的肌成纤维细胞参与肿瘤细胞的侵袭与血管重塑,CLIC4也可促进内皮细胞增生及诱导其演变成管状结构,通过提高细胞内液泡的酸化程度促进毛细血管形成。CLIC4可能是肿瘤浸润和转移过程中介导肿瘤细胞-间质相互作用信号轴的重要成分,但其具体机制仍需深入研究。综上所述,CLIC4参与调节肿瘤细胞的生长与分化,抑制肿瘤细胞的凋亡,还可能通过促进肿瘤间质内的成纤维细胞向肌成纤维细胞转化、促进肿瘤血管发生,维持肿瘤局部微环境的稳定性而影响肿瘤的侵袭和转移。因此,本研究拟通基因过表达和RNA干扰、不同CLIC4表达水平的肿瘤细胞诱导成纤维细胞的转分化、肿瘤细胞-成纤维细胞适应性侵袭和转移模型等系列研究,明确CLIC4调节结直肠癌的生长、分化、侵袭和转移的分子机制,使CLIC4成为对抗结直肠癌转移特性和对抗肿瘤微环境两个方面的重要靶向治疗候选分子,为实验性抗转移方案的建立和临床应用提供新靶标。针对CLIC4的靶向治疗,可能达到对抗结直肠癌转移特性和抗肿瘤微环境的双重目的,这正是当代抗肿瘤治疗／抗转移治疗的全新理念方法1.结直肠癌肿瘤相关成纤维细胞的的分离、培养及其鉴定利用原代培养法从人结直肠癌手术标本中分离培养人结直肠癌相关成纤维细胞,取临床手术切除的肠癌标本剪取小块粘膜组织,剪碎冲洗后剪成1mm3小块接种于透气塑料瓶加入20%FCS和终浓度为lugml的青、链霉素的DMEM置于37摄氏度、5%COz的培养箱中培养。培养7天后可观察到从组织块旁边有少量梭状的细胞贴壁爬出,换液5-6次后可观察到杂细胞逐渐死亡。同时对CCAF的取材、培养时间、培养条件等进行优化。分离出镜下具有典型形态的细胞后,用流失细胞技术对细胞进行Keratin阳性,Des分钟阳性表达率0.7%和FSP阳性表达率的鉴定。2.过表达CLIC4人结直肠癌细胞株的建立据报道的CLIC4基因序列设计特异性扩增人CLIC4cDNA全长的引物序列,分别在上下游引物的5’端引酶切位点。取处于对数期的细胞提取总RNA,取总RNA为模板,以cDNA产物为模板,P1和P2为引物,使用PCR技术扩增。取PCR产物用于琼脂糖凝胶电泳分析,余扩增产物经胶回收纯化。按UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收DNA片段。将纯化产物加A尾处理后制备感受态大肠杆菌DH5a。质粒T-A克隆连接转化后挑取转化质粒的单克隆,提取质粒后经PCR及双酶切鉴定为阳性者,送技术公司测序鉴定,并与GenBank公布的序列进行blast比对。采用ClaI和MluI限制性内切酶对pLVTHM载体进行双酶切,获得粘性末端线性化片段,将PCR扩增产物进行双酶切,胶回收获得粘性末端目的片断,将回收的目的基因片段与pLVTHM线性化片段按4：1进行连接反应。将连接产物进行转化后,经质粒小提后进行双酶切鉴定。对酶切鉴定正确的质粒进行全长双向测序鉴定,与GenBank公布的序列进行blast比对。慢病毒包装后测定病毒滴度。用含过表达的慢病毒、.阴性对照慢病毒以适当浓度分别感染17和40单克隆细胞。待细胞长至一定密度,转至培养瓶中继续培养,待细胞长满后,收集细胞进行Western blot鉴定。3.CLIC4表达干预的结直肠癌细胞与成纤维细胞共适应研究培养SW480、17号克隆(C17)、40号克隆(C40)、C17过表达CLIC4的稳定细胞株(C17-CICIC4)、C40过表达CLIC4的稳定细胞株(C40-CLIC4)以高糖DMEM+10%的胎牛血清培养,人胚肺细胞成纤维细胞株MRC-5使用高糖DMEM+10%的胎牛血清培养。裂解细胞取部分样品用BCA法测定蛋白质浓度,使用标准品的OD值绘制成标准曲线,计算出样品的总蛋白浓度。采用SDS-PAGE法检测表达蛋白的水平蛋白条带用Totallab软件(2.01版本)检测；以IOD值(积分光密度值)代表蛋白的强度,以目的蛋白与内参照蛋白(Tublin)的IOD比值作为目的蛋白表达水平的参数。取对数培养期各结直肠癌细胞株,MRC-5和CCAF进行细胞共培养,培养1周后取混合培养细胞制成单个细胞悬液,使用将MS分离柱和MACS Separator分立共培养细胞,使间接免疫荧光流式细胞计数检测MACS分离纯度。细胞的侵袭能力由answell小室侵袭实验进行。上下室之间铺孔径8μm的碳酸酯微孔滤膜,滤膜上包被metrigel胶(50μl/孔),分别用培养前后的SW480、C17、C40、 C17-CLIC、C40-CLIC4调整细胞数为5×105cells/ml。在200倍光镜视野下随机挑取3个视野计数滤膜下表面的细胞数,取其均值代表细胞的侵袭能力,并进行统计学分析。用TGFβ1和CLIC4in vitro刺激成纤维细胞,后进行Western Blot实验和激光共聚焦显微镜观察细胞免疫荧光实验。取SW480, C40-CLIC4, SW480+MRC-5, C40-CLIC4+MRC-5, C40+MRC-5,C40细胞用胰酶消化制成单细胞悬液,取4-5周龄雌性BALB/c裸鼠18只分为3组,分别将各组细胞注射在同一组裸鼠的左下背侧皮下、右下背侧皮下,注射细胞数为5×106个,每隔3-5天用游标卡尺测量瘤体直径,连续观察30天4.统计分析采用SPSS19.0统计软件进行数据分析,皮下成瘤试验采用重复测量方差分析,其他计量资料采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)；方差齐时,组间多重比较采用LSD法。方差不齐时用Welch法校正,多重比较采用Dunnett’sT3法；取α=0.05为显著性水平。结果：1.筛选和鉴定结直肠癌相关成纤维细胞：倒置相差显微镜观察：40倍镜下对原代培养人结直肠癌相关成纤维细胞进行观察细胞呈长梭状,大小较均一,呈贴壁网状生长,符合经典成纤维细胞结构。利用流式细胞技术标记检测原代分离的人结直肠癌成纤维细胞中的FSP、Des分钟、Keratin的表达,结果显示CCAF细胞中0.7%表达des分钟阳性,0.8%表达Keratin阳性,99.5%表达FSP阳性,符合成纤维细胞表型。2.结直肠癌CLIC4表达干预细胞模型的建立：pLVTHM-CLIC4重组质粒载体的构建及鉴定：抽提SW480细胞RNA逆转录为cDNA,以此为模板PCR扩增CLIC4基因cDNA全长,电泳分析PCR产物大小,CLIC4(761bp)电泳结果可见特异性条带与预计产物大小一致。电泳回收目的片段插入pGEM-TEasy克隆载体中,形成pGEM-T-目的基因,ClaI和M1uI双酶切鉴定得到正确克隆,克隆测序结果与GenBank里的人CLIC4基因序列相一致。真核表达载体pLVTHM-CLIC4的构建及鉴定：构建的质粒用ClaI和M1uI双酶切鉴定,得到的片段与预期结果一致。经包装细胞293FT包装的慢病毒,采用梯度法测定慢病毒的病毒滴度,病毒浓度从10-2到10-6稀释,并设立空白对照,测定的病毒滴度为6×105TU/ml。筛选并建立稳定的CLIC4过表达的C17和C40细胞株：用过表达的慢病毒及空白对照病毒分别感染C17和C40细胞株,扩大培养,从细胞感染病毒颗粒后荧光显微镜下观察到的结果表明慢病毒包装成功。稳定过表达CLIC4的C17和C40细胞株的鉴定：将pLVTHM空载体和pLVTHM-CLIC4重组表达载体分别转染C17和C40单克隆,Westem blot检测转染后蛋白表达水平的改变发现感染了pLVTHM-CLIC4的C17和C40的CLIC4表达均明显高于空载体C17和C40的单克隆细胞。3.CLIC4表达干预的结直肠癌细胞与成纤维细胞共适应研究：将共培养一周后的SW480+CCAF, C17+CCAF, C17-CLIC4+CCAF, C40+CCAF, C40-CLIC4+CCAF用MACS法分离后和同一培养条件下的SW480, C17, C17-CLIC4, C40, C40-CLIC4用体外运动小室(Transwell chamber)检测不同处理组细胞迁移能力的改变。将细胞接种到小室24hr后,将穿过8μm微孔的细胞计数三个高倍视野。表3-1和图3-1的结果显示：SW480+CCAF, C17+CCAF, C17-CLIC4+CCAF, C40+CCAF, C40-CLIC4+CCAF, SW480, C17, C17-CLIC4, C40, C40-CLIC4细胞中,所有结直肠癌细胞与CCAF共培养后细胞的体外迁移能力都显著增强(如SW480vs SW480+CCAF, F=180.023, P＜0.001; C17vs C17+CCAF, F=75.976, P＜0.001; C40vs C40+CCAF, F=450.126, P<0.001等);从多重比较的结果可以看出,C17-CLIC4、C40-CLIC4结直肠癌细胞的体外迁移能力分别显著强于C17、 C40。以上结果表明CLIC4和CCAF都可以增强结直肠癌细胞的体外迁移能力。共培养前后成纤维细胞α SMA表达水平的比较：将人胚肺成纤维细胞株MRE-5及原代培养的CCAF和SW480, C17, C17-CLIC4, C40, C40-CLIC4分别共培养后分离提取蛋白经行Western Blot检测α SMA的表达水平,同时使用经TGFβ1刺激的成纤维细胞株MRC-5作为阳性对照。结果显示经共培养后预先不表达α-SMA的MRC-5细胞的α SMA的水平与SW480, C17, C17-CLIC4, C40, C40-CLIC4中的CLIC4的变化趋势一致,而共培养前少量表达α SMA的CCAF共培养后αSMA水平的升高也与肠癌细胞株的CLIC4的变化趋势一致(图3-2)。同时检测五种结直肠癌细胞株中α SMA共培养前后表达水平的变化,作为参照。重组人CLIC4纯化蛋白体外刺激成纤维细胞α-SMA表达水平的比较：在人胚肺成纤维细胞株MRC-5及原代培养的CCAF中分别加入终浓度为5ng/mL和50ng/mL的重组人CLIC4纯化蛋白后,提取细胞蛋白进行Western Blot检测,使用TGFβ1(50ng/mL)刺激的成纤维细胞作为阳性对照,发现MRC-5和CCAFα的SMA表达水平的变化与CLIC4的浓度成正比。免疫荧光染色激光共聚焦显微镜观察结果：将MRC-5细胞和不同CLIC4表达水平的SW480,C17,C17-CLIC4, C40, C40-CLIC4细胞共培养后,观察在共培养状态下MRC-5的a-SMA表达水平在不同共培养组间的差异,结果显示MRC-5的α-SMA表达水平变化趋势结果与Western Blot实验结果一致(图3-5),并使用不同浓度重组人CLIC4纯化蛋白刺激MRC-5后检测α-SMA表达水平的变化趋势,结果与共培养结果一致。裸鼠皮下成瘤能力的比较：取前期试验中CLIC4差异较大,并且在与成纤维细胞共培养试验中α-SMA变化最显著的SW480,C40,C40+CLIC4经行皮下成瘤能力的比较。将SW480, SW480+MRC-5, C40, C40+MRC-5, C40-CLIC4, C40-CLIC4+MRC-5共6组细胞接种于18只裸鼠皮下,每组接种3只裸鼠。统计学结果表明：SW480+MRC-5的成瘤能力显著强于SW480(F=215.35,<0.001),细胞的成瘤能力随着时间发生变化(F=1004.69, P=0.004),而且细胞和时间之间存在交互作用(F=30.567,P<0.001),说明各细胞组成瘤能力的差异在不同时间不一。对每个时间单独分析发现：只有第30天SW480+MRC-5的成瘤能力显著强于SW480(P<0.001),其他时间无显著性差异。多重比较揭示,SW480和SW480+MRC-5的成瘤能力都随着时间的增加而显著增强(P均＜0.001)。 C40+MRC-5的成瘤能力显著强于C40(F=84.13,<0.001),细胞成瘤能力随着时间发生变化(F=328.86,<0.001),而且细胞和时间之间存在交互作用(F=28.11,P<0.001),说明各细胞组的差异在不同时间不一。对每个时间单独分析发现：只有第30天C40+MRC-5的成瘤能力显著强于C40(P<0.001),其他时间无显著性差异。多重比较揭示,C40和C40+MRC-5的成瘤能力都随着时间的增加而显著增强(P均<0.01)。C40-CLIC4+MRC-5的成瘤能力显著强于C40-CLIC4(F=14.19,<0.001),细胞的成瘤能力随着时间发生变化(F=500.08,<0.001),细胞和时间之间不存在交互作用(F=3.40,P=0.054),说明各细胞组的差异在不同时间是一样的。多重比较揭示,C40-CLIC4和C40-CLIC4+MRC-5的成瘤能力都随着时间的增加而显著增强(P均<0.05)。以上结果说明,SW480、C40、C40-CLIC与人成纤维细胞株MRC-5细胞共培养后皮下成瘤能力显著增强。结论1.10%FBS高糖MEM培养基植块法原代培养科可获得稳定传代结直肠癌相关成纤维细胞株2.CLIC4与结直肠癌的转移和侵袭相关。3.过表达CLIC4的结直肠癌细胞可促进成纤维母细胞向肌成纤维母细胞转换。4.结直肠癌相关成纤维细胞促进结直肠癌细胞的体外迁移能力,并且与肿瘤细胞的CLIC4表达有相关性。5.结直肠癌细胞和成纤维细胞共培养,可提高肿瘤细胞皮下成瘤能力,并且与CLIC4的表达水平有相关性。本研究的创新之处1.获得稳定传代结直肠癌相关成纤维细胞株1个和SW480来源的的单细胞源性克隆亚系4个。2.利用接触性共培养模型证实了CLIC4对成纤维母细胞向肌成纤维母细胞转换的作用。3.首次在结直肠肿瘤中证实了CLIC4可促进成纤维母细胞向肌成纤维母细胞转换,并且通过这种转换增加了肿瘤的皮下成瘤能力。初步确定了CLIC4作为结直肠癌转移分子标签的重要作用。4.为后续应用临床结直肠癌标本,CLIC4在患者肿瘤组织中的表达情况,并与患者的临床特性进行相关性分析摸索了条件。