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食管癌又被称之为食道癌,是食管腺以及食管粘膜的恶性上皮性肿瘤,临床主要有食管腺癌和食管鳞癌两种类型,而二者的病理转归及发病机制不同。食管癌的死亡率和发病率在全世界恶性肿瘤排行中分别居于第8位和第9位。食管癌呈地域性分布,西方国家以腺癌为主;在亚洲地区以鳞状细胞癌为主。我国食管鳞癌高发地在华北太行山脉附近,其中河南省林州市发病率最高。虽然食管癌方面的临床和基础研究已经持续了很多年,但其发病的原因尚不完全清楚。传统的治疗方法主要有手术治疗、放射治疗、化学疗法。患者在食管癌发病早期临床症状和体征无特异性,也没有特异性的肿瘤分子标志物,症状明显时多数病人已是肿瘤的中晚期,出现周围组织浸润或远端转移,失去了最佳治疗时机,这类患者5年的生存率小于10%。所以,寻找有效的诊断标志物和治疗干预的生物靶点及其作用的分子机制十分重要。Ets2为Ets转录因子家族成员之一,能够调控许多下游靶基因,通过蛋白之间的相互作用或者信号通路参与调节细胞的凋亡、分化、增殖、转移以及血管生成、器官发生等。Ets2在各种细胞和组织中均有表达,但是在不同的细胞和组织中其表达量和功能也具有差异性。研究发现,许多肿瘤中均发现转录因子Ets2存在表达异常的现象,可能与肿瘤的发生发展密切相关,转录因子Ets2可能成为肿瘤的一个潜在癌症诊断的标志物和治疗靶点。然而,目前关于转录因子Ets2对食管鳞癌细胞的影响报道较少,仅有研究显示转录因子Ets2在食管鳞癌组织中表达上调。因此深入研究转录因子Ets2在食管鳞癌发生发展中的作用机制,能够为研究食管鳞癌的发生机制及生物治疗提供理论基础和实验依据。本课题以转录因子Ets2为研究对象,检测其在正常食管上皮细胞和不同食管鳞癌细胞株中的蛋白水平表达差异,并采用RNA干扰技术靶向沉默Ets2基因,研究Ets2表达下降对食管鳞癌细胞生物学行为的影响,初步探讨Ets2在食管鳞癌发生发展中的作用。本课题主要分为两部分:第一部分:检测转录因子Ets2在食管鳞癌细胞株EC1、Eca109、EC9706中的蛋白表达情况。第二部分:研究转录因子Ets2在食管鳞癌发生发展中的作用。通过靶向特异性的si RNA阻断Ets2基因表达,检测Ets2表达下调对食管鳞癌细胞株增殖、侵袭、周期和凋亡的影响,并检测m TOR-p70S6K信号通路主要蛋白的表达情况,初步研究Ets2基因在食管鳞癌细胞中的生物学效应及作用机制。方法:1.食管鳞癌细胞中转录因子Ets2的表达情况利用Western blot技术从蛋白水平检测转录因子Ets2在正常食管上皮细胞Het-1A和食管鳞癌细胞株EC1、Eca109、EC9706中的表达。2.转录因子Ets2对食管鳞癌调控作用的初步探索体外化学合成3对针对Ets2基因m RNA的特异性si RNA,采用脂质体法转染食管鳞癌细胞株,通过Real-time PCR和Western blot筛选效率最高的si RNA片段。利用筛选到的si RNA转染食管鳞癌细胞,以转染非特异性si RNA的细胞、未转染si RNA的细胞及只加入了转染试剂的细胞作为对照,采用Ed U荧光标记法和CCK-8法检测食管鳞癌细胞增殖率和细胞存活率的变化;利用Annexin V-FITC/PI双染法及caspase-3的蛋白水平表达情况分析细胞凋亡的变化;流式细胞仪检测食管鳞癌细胞周期的变化;Transwell小室法检测食管鳞癌细胞侵袭能力的变化,Western blot检测E-cadherin的表达情况来反应食管鳞癌细胞粘附能力的变化;通过Western blot检测m TOR/p70S6K途径主要蛋白的表达水平变化。结果:1.食管鳞癌细胞中转录因子Ets2的表达情况Western blot结果显示,转录因子Ets2在正常食管上皮细胞和食管鳞癌细胞株中均有表达,与正常食管上皮细胞Het-1A相比,Ets2在食管鳞癌细胞EC1、Eca109和EC9706中的蛋白表达量均明显升高,尤其在EC9706细胞中增加最为显著,因此采用EC9706细胞筛选si RNA干扰片段。2.转录因子Ets2对食管鳞癌调控作用的初步探索3对Ets2基因的特异性si RNA干扰片段中,Ets2 si RNA1在转染48 h后,转录水平和蛋白水平的沉默效果相对较好,因此选用Ets2 si RNA1片段转染食管鳞癌细胞系EC1、Eca109、EC9706进行后续实验。与对照组相比,靶向si RNA下调Ets2基因表达后,可以明显地抑制食管鳞癌细胞的增殖;Ets2 si RNA组的食管鳞癌细胞的早期凋亡比例上升,凋亡蛋白caspase-3的蛋白水平表达增多,说明下调Ets2基因能够促进细胞凋亡;Ets2表达下调的食管鳞癌细胞Eca109、EC1的G0/G1期细胞明显增加;减弱食管鳞癌细胞侵袭能力,且E-cadherin的蛋白表达上升说明食管鳞癌细胞的粘附能力增强;此外,Western blot检测显示Ets2 si RNA组m TOR/p70S6K信号通路中的关键蛋白p-m TOR和p-p70S6K的表达量明显下降。结论:1.转录因子Ets2在三株食管鳞癌细胞中均呈高表达;2.靶向si RNA下调Ets2表达后,食管鳞癌细胞的增殖能力减弱,促进细胞凋亡,细胞周期被阻滞在G0/G1期,细胞的侵袭能力减弱,说明转录因子Ets2表达下调能够有效抑制食管鳞癌细胞生长和侵袭;3.Ets2表达下调的食管鳞癌细胞株中,m TOR/p70S6K中关键因子表达量明显下调,初步推测Ets2可能通过m TOR/p70S6K信号通路在食管鳞癌发生发展中发挥作用。