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肾脏是泌尿系统的重要组成器官,其主要功能是通过调节肾小管对水、离子、葡萄糖、营养物质等的重吸收以及通过肾小球滤过去除代谢产物来维持内环境的稳定。当肾脏受到损伤后机体内环境的稳定被破坏,其他脏器的功能也会受到影响。研究发现:肾功能损伤时,其他重要脏器如肝、肺等的结构和功能也会出现改变。肾缺血再灌注损伤（Renal Ischaemia-reperfusion injury,RIRI）在临床外科多见于高血压、肾脏移植和肾动脉阻断等手术治疗过程中,是导致急性肾损伤、肾移植后功能恢复延迟、急性肾衰的重要原因之一,具有较高的发病率和死亡率,严重影响病人的愈后。到目前为止,缺血再灌注损伤的确切病理生理机制尚不清楚。但研究表明:肾缺血再灌注损伤是由于到达肾脏的血液供应被突然暂时性阻断进而再重新恢复导致的。在缺血-再灌注过程中肾脏会处于高度氧化应激状态,进一步损伤肾脏的功能。因此,氧化应激已被研究者们认为是RIRI的重要因素之一。超氧化物歧化酶（superoxide dismutases,SOD）是一个蛋白酶家族,通过清除超氧阴离子在保护组织免遭氧化应激损伤中发挥重要作用,进而防止其他更有效的氧化剂如过氧亚硝基阴离子和羟基自由基的形成。细胞外超氧化物歧化酶（Extracellular SOD,EC-SOD）主要是在组织的细胞外基质中被发现的,被认为能有效地阻止细胞外ROS所引发的细胞和组织损伤。研究已发现:EC-SOD在几种间质性肺疾病模型如肺纤维化均具有保护作用。此外,EC-SOD的基因表达在人类特发性肺纤维化中也发生了改变。脑组织是对缺血缺氧反应高度敏感的器官,在肾脏缺血再灌注损伤发生处于高度氧化应激状态时,脑组织是否也处于氧化应激状态并遭受过氧化损伤?EC-SOD的表达如何改变,在此过程中是否发挥抗氧化作用?本研究首先使用无损伤血管夹夹闭肾动脉建立大鼠RIRI模型。再灌注24小时后取大鼠脑组织检测其H2O2以及MDA的含量,再检测EC-SOD m RNA和蛋白水平发生的表达变化,并对H2O2含量、MDA含量与EC-SOD表达水平进行相关性分析。探讨RIRI对脑内氧化应激的影响,以及在此过程中EC-SOD可能起到的抗氧化作用,为防治RIRI诱发的脑组织损伤提供一条新途径。目的:观察大鼠RIRI模型脑内的丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量、H2O2含量、抗氧化酶EC-SODm RNA表达水平、EC-SOD蛋白表达水平、以及MDA含量、H2O2含量与EC-SOD表达水平的相关性,探讨RIRI对脑内氧化应激的影响,以及在此过程中EC-SOD可能起到的抗氧化作用。方法:1大鼠肾缺血再灌注损伤模型制备、分组及取材12只体重200±10 g的雄性Wistar大鼠随机分为对照组（Con）和肾缺血再灌注损伤组（RIRI）,各组6只。RIRI大鼠模型的制备:首先6%水合氯醛按5ml/kg标准进行腹腔注射,用以大鼠麻醉。然后将RIRI组大鼠切开腹壁暴露两侧肾脏,切除其右肾,然后钝性分离左侧肾动脉,于肾门处用无创伤动脉夹夹闭左肾动脉,随后即可观察到肾的颜色由鲜红逐渐变暗失去光泽转为暗红色。夹闭45分钟移除动脉夹,恢复左侧肾脏血液供应,肉眼可见左侧肾动脉再次充盈,颜色由暗红色迅速恢复为鲜红色,表明左肾血液再灌注成功。Con组大鼠切开腹壁后切除右侧肾脏,于左侧肾门处分离左肾动脉,但是并不夹闭。血液再灌注24小时后,再次麻醉大鼠,在大鼠右颈总动脉收插管收集大鼠血液5ml,血液3000rpm离心10min,收集血清用来检测肌酐（Serum Creatinine,SCr）和尿素氮（Blood Urea Nitrogen,BUN）的浓度;取大鼠左肾和脑,将左侧肾脏置于4%多聚甲醛溶液中进行固定,采用HE染色法观察左侧肾脏的形态结构。脑组织置于液氮中-80度冰箱保存,用于MDA含量、H2O2含量、抗氧化酶EC-SOD m RNA表达水平、EC-SOD蛋白表达水平的测定。2观测指标及其方法2.1血清中SCr和BUN水平的检测血清中SCr的含量用苦味酸法检测;血清中BUN的含量用酶偶联速率法检测。2.2采用HE染色法观察大鼠左肾的形态结构左侧肾脏经乙醇脱水、二甲苯透明,石蜡包埋后,用莱卡切片机切片厚约5μm,采用苏木精伊红染色树胶封片后,在奥林巴斯光学显微镜下观察左侧肾脏的形态结构。2.3制备大鼠脑组织匀浆液以及测定其MDA的含量将脑组织从-80℃冰箱中取出,按照10mg/100μl标准加入4度匀浆缓冲液。匀浆缓冲液包含:磷酸钾缓冲液50mmol/L,盐酸苯甲脒1mmol/L,PH7.4,PMSF1mmol/L,Na Cl0.5mol/L,0.1%Tween-20,EDTANa3 1mmol/L,5mmol/Lβ-巯基乙醇。在冰浴下脑组织匀浆2分钟,4000rpm 4℃离心匀浆液20min,取上清即为10%脑组织匀浆液。脑组织匀浆液中MDA的含量用南京建成丙二醛（MDA）含量测定试剂盒检测。2.4制备大鼠脑组织匀浆液及测定其H2O2的含量将脑组织从-80℃冰箱中取出,按照10mg/100μl标准加入4度匀浆缓冲液。匀浆缓冲液包含:磷酸钾缓冲液50mmol/L,盐酸苯甲脒1mmol/L,PH7.4,PMSF1mmol/L,Na Cl0.5mol/L,0.1%Tween-20,EDTANa3 1mmol/L,5mmol/Lβ-巯基乙醇。在冰浴下脑组织匀浆2分钟,4000rpm 4℃离心匀浆液20min,取上清即为10%脑组织匀浆液。脑组织匀浆液中H2O2含量用钼酸比色法检测,过氧化氢的含量用mmol/g pro显示。2.5大鼠脑组织细胞外超氧化物歧化酶m RNA水平测定用Trizol法提取大鼠脑组织的总RNA。将3μg总RNA反转录生成c DNA。PCR后,以GAPDH作为内参照。将细胞外超氧化物歧化酶的扩增产物与内参照进行灰度值比,其比值作为细胞外超氧化物歧化酶m RNA的相对表达量。2.6大鼠脑组织细胞外超氧化物歧化酶蛋白水平测定用Western blot法测定大鼠脑组织中细胞外超氧化物歧化酶的蛋白表达水平。将大鼠的脑组织制备成匀浆液,离心后取上清。采用改良Lowry法测定蛋白总量,蛋白的电泳上样量为62 ug,电泳、转膜、封闭后,在PVDF膜上滴加兔抗细胞外超氧化物歧化酶的一抗,室温下静置过夜。第二天洗膜后加入用荧光标记的抗兔Ig G二抗,双色红外线成像系统扫描照相后并进行图像分析。2.7大鼠脑组织MDA含量、H2O2含量与EC-SOD表达水平相关性分析脑组织MDA含量、H2O2含量与EC-SOD表达水平双变量间关系采用Pearson相关性分析。结果:1大鼠肾组织形态学改变奥林巴斯光学显微镜下显示:Con组大鼠的肾小球、近曲及远曲小管、集合管的形态结构清晰规整未见异常。RIRI组大鼠可见肾小囊腔扩张明显;肾血管球萎缩;近曲及远曲小管管腔也出现扩张,偶尔可见小管上皮细胞胞浆疏松化;肾间质出现水肿,间隙扩大;集合管也呈现管腔扩张等改变。2血清SCr水平RIRI组血清SCr浓度为131.153±17.814μmol/L,Con组大鼠血清SCr浓度为103.444±8.465μmol/L,RIRI组血清SCr浓度明显高于Con组,P<0.05。3血清BUN水平RIRI组血清BUN浓度为13.685±4.397 mmol/L,Con组大鼠血清BUN浓度为4.462±0.541 mmol/L,RIRI组血清BUN浓度明显高于Con组,P<0.05。4脑组织匀浆内MDA含量RIRI组脑匀浆MDA含量为11.67±2.33 mmol/g,Con组大鼠脑匀浆MDA含量为7.67±1.77mmol/g,RIRI组脑匀浆MDA含量明显高于Con组,P<0.01。5脑组织匀浆内H2O2含量RIRI组大鼠脑匀浆H2O2含量为30.68±3.07 mmol/g,Con组大鼠脑匀浆H2O2含量为20.41±2.36 mmol/g,RIRI组大鼠脑匀浆H2O2含量明显高于Con组,P<0.01。6脑组织EC-SOD m RNA表达水平RT-PCR法测定大鼠脑组织细胞外超氧化物歧化酶m RNA表达水平。RIRI组大鼠脑组织细胞外超氧化物歧化酶m RNA表达水平（0.94±0.12）明显高于Con组大鼠（0.57±0.11）,P<0.01,表明:RIRI组大鼠脑组织EC-SOD基因表达水平增强。7脑组织EC-SOD蛋白表达水平Western blot法测定大鼠脑组织细胞外超氧化物歧化酶蛋白表达水平。RIRI组大鼠脑组织细胞外超氧化物歧化酶蛋白表达水平（0.71±0.08）明显高于Con组大鼠（0.49±0.08）,P<0.01,表明:RIRI组大鼠脑组织细胞外超氧化物歧化酶蛋白表达水平升高。8脑组织MDA含量、H2O2含量与EC-SOD表达水平的相关性脑组织MDA含量与EC-SOD m RNA表达水平（r=0.629,P<0.05）、脑组织MDA含量与EC-SOD蛋白表达水平（r=0.651,P<0.05）、脑组织H2O2含量与EC-SOD m RNA表达水平（r=0.832,P<0.01）、脑组织H2O2含量与EC-SOD蛋白表达水平（r=0.791,P<0.01）之间均呈正相关关系结论:1 RIRI可使其脑组织处于高度的氧化应激状态,脑组织遭受过氧化损伤。2肾缺血再灌注损伤发生后,抗氧化酶EC-SOD基因和蛋白表达水平明显增强,并与脑组织MDA含量、H2O2含量均呈正相关。表明EC-SOD在此过程中可能发挥了抗氧化应激作用。