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研究目的对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)是临床常用的解热镇痛类非处方药。过量服用APAP会引起严重的急性肝损伤,最终诱发急性肝衰竭。线粒体损伤被认为是APAP肝毒性中的关键事件,它不仅影响ATP生成,还可引起肝细胞内的钙稳态失衡以及激活炎性反应进一步加重肝脏损伤。Calpain是一类胞浆内存在的钙依赖蛋白水解酶,广泛参与多种病理生理过程。然而到目前为止,Calpain是否参与APAP诱导的肝损伤国内外尚未见报道。本研究通过建立APAP剂量-反应关系模型和Calpain抑制剂ALLN干预模型,检测肝脏中Calpain降解系统、线粒体动态、线粒体自噬相关蛋白及NF-κB-NLRP3信号通路的变化,探讨Calpain在APAP肝损伤中的作用及其分子机制。研究方法1动物模型建立(1)APAP小鼠肝损伤的剂量-反应关系模型:适应性喂养雄性C57/BL 6小鼠3天后,选取40只随机分为4组:对照组、APAP低剂量组(180 mg/kg.bw)、中剂量组(300mg/kg.bw)和高剂量组(500 mg/kg.bw)。禁食12 h后,采用腹腔注射的方式给予小鼠APAP溶液,对照组小鼠注射生理盐水。给药24h后,摘眼球取血并摘取小鼠肝脏组织。(2)APAP小鼠肝损伤的ALLN干预模型:适应性喂养雄性C57/BL 6小鼠3天后,选取40只随机分为4组:对照组、ALLN组、APAP组、ALLN+APAP组,每组10只小鼠。禁食12h后,采用腹腔注射的方式给予对照组生理盐水,ALLN干预组注射20 mg/kg.bw ALLN溶液,APAP组腹腔注射300 mg/kg.bw APAP溶液,ALLN干预组提前1 h以20 mg/kg.bw剂量腹腔注射ALLN溶液后给予300mg/kg.bw APAP,24h后摘眼球取血和肝脏组织。2生化指标、肝脏病理、Calpain活性及蛋白表达水平的检测(1)检测小鼠血清中的ALT、AST,称取肝重并计算肝脏系数,剪取同一位置的肝脏依次进行病理切片、HE染色,检测病理损伤。(2)APAP剂量-反应模型小鼠匀浆肝组织后,提取总蛋白,采用Western Blot技术检测Calpain相关蛋白的表达。(3)ALLN干预模型小鼠匀浆肝脏组织后,用GENMED组织钙蛋白酶(Calpain)活性荧光定量检测试剂盒检测Calpain活性改变,并分别提取总蛋白、线粒体蛋白、胞浆蛋白、胞核蛋白,利用Western Blot检测Calpain相关蛋白、线粒体动态相关蛋白、线粒体自噬相关蛋白及炎症相关蛋白的表达变化。3透射电镜观察线粒体损伤取小鼠肝脏同一部位组织1mm3,迅速浸入预冷的3%戊二醛固定液,2h。浸洗后固定于1%OsO4,1h,经乙醇梯度脱水后包埋于Epon812树脂。用醋酸双氧铀和柠檬酸铅对小鼠肝脏超薄切片进行双重染色,然后用JEOL-1200EX透射电子显微镜观察并选取视野进行拍照。4对肝组织进行免疫荧光染色常规制备小鼠肝脏石蜡切片,小鼠肝脏(5μm)的石蜡切片进行脱蜡和水化处理。然后,将切片浸入柠檬酸盐缓冲液中并微波加热至92℃持续10 min进行抗原修复。为了进行免疫荧光染色,首先用0.3%TritonX-100室温透膜10 min,再将切片用5%BSA室温封闭30 min,然后与一抗孵育过夜。第二天,将切片与荧光二抗在室温下避光孵育1-1.5 h。细胞核用Hoechst 33343染色,并用SlowFade Antifade Mountant进行封片处理。最后,用尼康荧光显微镜观察染色的切片并选取视野进行拍照。研究结果1 APAP诱导小鼠急性肝损伤中Calpain活性变化过量的APAP导致小鼠严重肝损伤,表现为血清ALT和AST活性增加以及广泛的肝小叶坏死。在APAP处理组中观察到ALT和AST的剂量依赖性增加(p<0.05)。组织病理学检查显示APAP组的肝脏切片具有不同程度的小叶肝细胞坏死,伴有肝细胞的颗粒变性和炎性细胞浸润。更重要的是,APAP处理激活了钙蛋白酶降解途径。与对照组相比,μ-Calpain,m-Calpain和Calpastatin裂解产物的水平均显著增加,且具有明显的剂量-反应关系。2 Calpain干预药物ALLN对Calpain活性、线粒体动态、线粒体自噬及炎症反应的影响(1)ALLN干预对APAP诱导的急性肝损伤及Calpain活性的影响:ALLN预处理可显著减轻APAP染毒小鼠的ALT和AST水平,并减少肝坏死面积。在染毒APAP之前用20 mg/kg ALLN处理的小鼠中,血清ALT和AST的活性明显降低至接近正常小鼠的水平。而且,组织病理学分析进一步证实了 ALLN干预实验的生化评估。此外,ALLN预处理可显著抑制APAP染毒小鼠的钙蛋白酶降解途径的激活。(2)ALLN干预对线粒体动态相关蛋白及线粒体损伤的影响:Western blot结果发现APAP染毒组Drp1水平明显增加,ALLN干预后Drp1的表达显著下降,此结果与免疫荧光结果一致;与对照组相比,模型组线粒体融合蛋白MFn2和OPA1的表达水平降低,ALLN预处理组MFn2与OPA1表达增加,表明APAP处理促使线粒体分裂增强,线粒体融合减弱,透射电镜观察到线粒体损伤加重,而ALLN干预能扭转此情况。(3)ALLN干预对线粒体自噬的影响:Western Blot结果提示APAP模型组全蛋白及线粒体提取组分中自噬及线粒体自噬相关蛋白P62、P-P62、LC3、Pink1、Parkin的表达均显著增加;与模型组相比,ALLN预处理组中这些蛋白的表达水平均明显下降。(4)ALLN干预对APAP诱导的NF-κB-NLRP3炎症通路的影响:APAP暴露导致IKK水平显著增加,并且NF-κB(p65)明显发生核易位。相比之下,ALLN预处理明显抑制了NF-κB上游信号IKK的水平及NF-κB从肝细胞质到核的转运。更重要的是,APAP染毒使小鼠肝脏中NLRP3、caspase-1、IL-1β的水平显著增加,与对照组相比具有统计学差异。且caspase-1的活性形式和成熟的IL-1β在APAP染毒后也显著升高。与模型组相比,ALLN的干预明显降低了 APAP染毒引起的NLRP3、caspase-1和IL-1 β的增加。结论1.过量APAP引起小鼠急性肝损伤,并激活Calpain降解系统。2.Calpain抑制剂ALLN能抑制APAP诱导的线粒体片段化和肝脏炎症反应。3.ALLN能有效保护APAP诱导的急性肝损伤。