急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是影响人类健康的最主要疾病之一。一旦发生，将产生严重后果：缺血区心肌发生不可逆性坏死，导致具有收缩功能的心肌细胞数目减少；残余心肌细胞代偿性肥大、凋亡；成纤维细胞分泌大量的胶原组织在局部沉积，形成瘢痕组织替代坏死心肌，从而导致梗死心肌结构的重建，心肌弹性下降，心室壁扩张变薄，心功能降低，最终死亡或极大的影响患者的生活质量。 几十年来，为了治疗心肌梗死(myocardial infarction,MI)和由之引起的心力衰竭，人们想了很多办法，包括药物治疗、介入治疗、外科手术搭桥、心脏移植、机械辅助甚至全人工心脏等。然而，对于大面积、弥漫性的冠心病患者来说，以上方法很难遏制、逆转病情的发展，患者的获益是有限的。因此，作为一种很有希望的MI和／或心力衰竭的治疗手段，细胞移植在过去的10年中逐渐引起了人们的注意。目前已经有很多细胞被研究用来作为缺血心肌内细胞移植的供体，包括心肌细胞、平滑肌细胞、胚胎干细胞、骨髓干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)、骨骼肌成肌细胞、肝脏干细胞等。其中BMSCs是目前最有前景的一类心肌内细胞移植供体。首先，BMSCs具有极强的分化潜能，能够分化为心肌细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞；其次，BMSCs分化的心肌细胞能与受体心肌细胞形成有效的电-机械耦联，从而达到同步收缩，改善心功能的目的，这是骨骼肌成肌细胞移植所不具备的；第三，BMSCs可以分泌促细胞和血管生长因子；第四，BMSCs容易从自体采集，移植前可在体外培养增殖，或通过细胞因子动员BMSCs移行至外周血，直接参与心肌损伤的修复。避免了胚胎干细胞移植所面临的伦理学纠纷；第五，自体BMSCs移植不存在免疫排斥反应。因此，不论基础研究，还是临床应用，多数研究者们青睐于BMSCs。 BMSCs的分化特性是人们最感兴趣的地方。1995年，Wakitani等人首先发现，经5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)和两性霉素或单独两性霉素处理后，骨髓基质细胞(BMSCs组成之一)在体外可以分化为肌细胞。不久前Makino等人在体外利用3μmol／L的5-aza诱导骨髓基质细胞，发现部分克隆可以分化为具有自主收缩功能的心肌样细胞。其诱导BMSCs分化为心肌样细胞的确切机制尚不清楚。Konieczny等在研究小鼠胚胎细胞系向肌源性分化的过程中指出，这些细胞包含有一个甲基化状态的肌原决定区基因座，因此处于转录失活状态。而5一aza可使其去甲基化，激活转录，从而促使其向肌性细胞分化。 此外，治疗性血管新生也在改善缺血性心脏病患者心功能及生活质量方面表现出了满意的效果。目前人们已经将多种血管生长因子用于临床I期实验，初步结果表明，促血管生长作用满意。其中血管内皮生长因子(vascular endothehalgrowth factor，VEGF)是一种强大的促血管生长因子，在缺血心肌内具有良好的促血管生长作用。 由此可见，通过5一aza诱导的细胞移植修复缺血坏死心肌组织，或通过血管生长因子的持续、稳定、有效表达促进缺血心肌局部血管新生，将是很有希望的两种治疗手段。因此，为寻找一种更加有效的治疗缺血性心脏病的新疗法，我们假想l)富含骨髓各种干细胞的骨髓单个核细胞(bone marrow mononuelear eells，BM一MNCs)经5一aza诱导后，被赋予了更多的收缩蛋白和结构蛋白，将其移植于缺血心肌后，也许能进一步改善心功能;2)表达VEGF基因的BM一MNCs移植于缺血心肌后，除了能通过移植细胞修复受损心肌以外，还能通过血管新生改善局部血供、挽救自体受损心肌，并为移植细胞提供一个良好的生存环境，有可能在更大程度上改善心功能，从而达到协同治疗效果。本研究的主要内容包括三个部分。 1 .BM一MNCs的体外分离培养和向心肌样细胞的诱导分化。利用Ficon密度梯度离心法体外分离BM~MNCs，培养于含有20%胎牛血清的DME树F12培养基内，观察其细胞组成、形态学变化、及生长增殖情况。应用5一aza诱导BM一MNCs中的基质细胞等向心肌样细胞分化，并从形态学(光镜、电镜)、免疫细胞化学两方面予以证实。 2.5一aza诱导的BM一MNCs移植于缺血心肌的实验研究。选取日本大耳白兔犯只，体重2.0一2.SKg。通过胸骨左缘开胸，结扎左冠状动脉前降支，建立AMI模型。随机分为如下4组:组I(BM一MNCs+5一aza组):注射5一aza诱导的BM一MNCs100林l，n二8;组11(BM一MNCs组):注射未经5一aza诱导的BM一MNes 100卜l，n=8;组111(AMI对照组):注射无血清DMEM/F，2培养基10郎l，n二10:组W(假手术组):只开胸，不结扎，不注射。细胞移植前均经5一澳脱氧尿普(BrdU)标记。所有动物于细胞移植后4周采用超声心动图评价心功能。实验结束时，行左心导管通过血流动力学情况评价心功能。然后取组织，采用、乞n Gieson染色和免疫荧光技术检测，主要观察组织重构和细胞存活分化、血管新生等情况。 3.转染恤VEGF，65的BM一MNCs移植于缺血心肌的实验研究。phvEGF，65是含hVEGF165eDNA的peR3表达载体。移植前经脂质体包裹phvEoF165转移至培养的BM一MNCs，孵育24h。并通过免疫荧光技术检测hVEGF165在细胞内的表达情况。然后进行细