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目的:越来越多的研究表明G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors,GPCRs)具有核转位现象,即原定位于细胞膜上的受体内化后能进一步定位于核膜上或者移位进入核内,介导不同于其在细胞膜上所介导的信号传导通路进而发挥不同的生物学功能。PAC1-R是神经肽垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP)的特异性受体,本课题组已有的研究表明:PAC1-R内化后是进一步定位于核膜或者进入到核内。本文将进一步探索能诱导PAC1-R核转位现象的因素及PAC1-R核转位所介导的可能的生物学作用。方法:(1)首先在高表达PAC1-R的PAC1-eGFP-CHO细胞上使用免疫荧光法检测梯度浓度(10n M、100n M、1μM)的PACAP38对PAC1-R核转位的诱导作用,并用Western blot、多功能生物发光法分别检测PACAP38处理后细胞各组分中PAC1-R的趋势变化,并在天然高表达PAC1-R的野生型细胞RGC-5中检验PACAP38对PAC1-R核转位的诱导。(2)其次在PAC1-eGFP-CHO细胞中检测PACAP38的C-末端短肽PACAP(28-38)及TAT(YGRKKRRQRRR)对PAC1-R核转位的诱导,比较其与PACAP38的N端短肽类似物PO13对诱导PAC1-R的入核效率。(3)随后在PAC1-eGFP-CHO细胞与RGC-5细胞中检测本课题组人工合成的小分子正向别构调节剂sPAM1对PAC1-R核转位的诱导。(4)随后在PAC1-eGFP-CHO细胞中检测光对PAC1-R核转位的诱导,探索PAC1-R的核转位可能涉及的生理学反应,并进一步通过Western blot检测蓝光诱导PAC1-R核转位后PAC1-R蛋白的变化。(5)在RGC-5细胞中验证PACAP38、sPAM1对PAC1-R核转位诱导过程中PAC1-R整体水平的变化。(6)在得出的实验结果基础上,结合前人研究,尝试对PAC1-R的核转位机制提出分析。结果:(1)在PAC1-eGFP-CHO细胞发现:梯度浓度的PACAP38(10 n M、100 n M、1μM)均能诱导PAC1-R有效内化后在核膜周边募集,并在募集到一定程度后入核,发生核转位;且存在激动剂浓度依赖性与动态循环现象。然而不同于PACAP38在PAC1-eGFPCHO细胞中对PAC1-R核转位有显著的诱导效果,RGC-5细胞中并不能检测到有统计学意义的核转位效果。(2)TAT、PACAP(28-38)均属于富含阳离子精氨酸的肽(CARPs),均能有效诱导PAC1-R的核转位,而PACAP38的N端短肽PO13诱导PAC1-R进入细胞核的速率低于PACAP(28-38)、TAT。推论:PAC1-R的别构调节(PAM)区域可能参与介导PAC1-R本身的高效核转位。(3)sPAM1不是CARPs,与PAC1-R呈结构性结合而非电荷结合,但sPAM1也能诱导PAC1-R的核转位。sPAM1不仅能诱导PAC1-eGFP-CHO细胞的核转位,也能诱导RGC-5细胞的PAC1-R的核转位。初步证实了:靶向PAC1-R的N端胞外域的PAM位点的结合参与介导PAC1-R有效的核转位。(4)与红光相比,蓝光能更有效诱导PAC1-R的核转位。蓝光诱导后核内PAC1-R的位置与染色体DNA的位置重叠;核内PAC1-R片段化,且核内C-端片段化程度与蓝光照射时间成正比。此外,蓝光诱导的PAC1-R的核转位现象可被ROS抑制剂NAC、棕榈酰化抑制剂2-BP所抑制。提示:蓝光诱导的PAC1-R核转位现象可能与活性氧、棕榈酰化相关。(5)RGC-5细胞中,PACAP38、sPAM1均能显著诱导PAC1-R表达的上调。提示:PAC1-R核转位可能参与介导PAC1-R的上调。结论:PACAP38、TAT、PACAP(28-38)、PO13、靶向PAC1-R的小分子别构调节剂sPAM1和蓝光等因素均能诱导PAC1-R核转位,且PAC1-R核转位过程中存在浓度依赖性与动态循环现象。而TAT、PACAP(28-38)、PO13之间对PAC1-R核转位的诱导效率之间存在差异,提示PAC1-R的PAM区域可能参与介导PAC1-R本身的高效核转位,这一推论在sPAM1显著诱导PAC1-R核转位过程中得到初步证实。PAC1-R的核转位可能涉及到氧化应激相关的ROS和棕榈酰化等,并可能通过导致PAC1-R启动子活性的增加,进而导致PAC1-R的表达上调,从而启发后续信号通路,实现响应应激。