巨自噬(以下简称自噬)是真核细胞中一种保守的溶酶体依赖的降解机制。胞质中内源性的长寿命蛋白和多余或异常的细胞器被双层膜包被,形成泡状结构,称为自噬小体。后者与溶酶体或内体发生质膜融合。自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autophagolysosome),溶酶体酸性水解酶将自噬溶酶体的内膜和包含物降解成氨基酸、单糖、核苷酸等小分子,被细胞重新利用,从而实现营养物质的循环和受损细胞器的清除。这一过程不仅仅为细胞的基础功能提供养料,同时在抵抗微生物侵入、蛋白错误折叠、内质网胁迫、氧化压力过程中提高细胞适应性促进存活。另一方面,自噬还是一种细胞死亡方式,称为Ⅱ型程序性细胞死亡,它有利于保护细胞内环境,清除有害物质,维持机体稳定和更新。越来越多的实验证据表明自噬参与许多重大疾病,包括神经退行性病变、肿瘤、动脉粥样硬化和老化等,因此自噬研究具有极为重要的病理生理学意义。血管内皮细胞是覆盖在血管内膜表面并且相互紧密连接的单层细胞,它有效地将血液和血管壁分隔开来。血管内皮细胞具有信息传递、内分泌、参与凝血、炎症反应和血管生成等多种重要的生理功能。因内皮细胞功能紊乱而引起的高血压、动脉粥样硬化、心力衰竭、脑卒中等疾病严重威胁着人类的健康和生命。维持内皮细胞正常功能具有重大临床意义。目前越来越多的研究关注于自噬及其调控在血管内皮细胞正常生理功能中发挥的作用,那么血管内皮细胞自噬的内在分子机制是什么?启动血管内皮细胞自噬的分子开关到底有哪些?它们是否参与经典的自噬信号通路呢?这些都有待于进一步深入研究。膜联蛋白(Annexins)是广泛存在于动植物中的一类Ca2+调节的,与带负电荷膜磷脂相结合的一类保守的蛋白超家族。在细胞中参与膜转运和膜表面一系列依赖于钙调蛋白的活动,包括囊泡运输、胞吐作用中的质膜融合、信号传导和钙离子通道的形成、炎症反应、细胞分化和细胞骨架蛋白间的相互作用等。目前已知Annexin家族成员约有20多种,分A、B、C、D、E五大类。所有Annexin超家族成员均具有一个保守的中心结构域(core domain)和一个发挥各自独特功能的N端结构域。其中心结构域为含有重复序列的保守结构,由4个同源的重复序列(annexin A6含有8个同源的重复序列)组成,每个重复序列含有70-80个氨基酸残基组成的5个α螺旋,排列成弯曲的盘状。Annexin的N端均含有钙结合蛋白s100蛋白家族共有的钙结合位点和磷酸化位点。肿瘤抑制基因annexin A7 (ANXA7)定位与染色体10q21上,转录后经过不同的剪切形成两种异形体,分子量分别是47kD和51 kD。ANXA7与钙离子和磷脂结合发挥Ca2+激活的GTPase活性参与质膜融合。二型肺泡细胞在分泌表面活性物质时需要片层体与细胞质膜融合。信号脂类,如甘油二脂(DAG)和磷脂酰肌醇-4,5二磷酸(PIP2)可以调节ANXA7的质膜融合特性。分离的片层体用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)或磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C(PC-PLC)处理后,ANXA7的融合活性明显增强。本论文利用化学遗传学结合分子生物学的方法,研究血管内皮细胞自噬的调控,探讨膜联蛋白ANXA7在内皮细胞自噬中的作用,并进一步揭示ANXA7在自噬调控中的分子机理。从而深化对血管内皮细胞自噬机制的认识,为自噬调控提供新的有效的工具,并为临床诊疗新策略提供科学的理论依据。研究内容1.在去除血清和生长因子条件下低浓度镉离子(Cd2+,<10μM)诱导人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)自噬并抑制细胞凋亡作用。2.低浓度镉离子诱导血管内皮细胞自噬的作用机理。3.苯并噁嗪衍生物ABO诱导正常培养的血管内皮细胞发生自噬。4.ANXA7在ABO诱导血管内皮细胞自噬中的作用。5.ABO参与自噬调控的分子机理。研究方法1.血管内皮细胞的分离与培养：参考Jaffe等的方法(Jaffe et al.,1973)。2.细胞自噬和自噬流的检测：1)吖啶橙染色结合荧光显微镜观察血管内皮细胞中酸性膜泡的数量及分布。2)吖啶橙染色结合流式细胞技术检测细胞中酸性膜泡的数量。3)免疫细胞化学法检测自噬标志物MAP1 LC3蛋白在细胞内的定量和分布。4)利用Western blot法检测LC3-Ⅱ、beclin1和p62的蛋白水平分析自噬小体的数量以及自噬流的完整性。5)利用自噬诱导剂rapamycin诱导自噬以检测ABO引发的自噬和自噬流。6)利用自噬抑制剂3MA、bafilomycin A1以检测ABO引发的自噬和自噬流。7)利用Western blot法检测mTOR信号通路的下游靶点p70S6K和4EBP1的磷酸化情况。3.细胞凋亡检测：1)倒置相差显微镜观察细胞形态变化。2)吖啶橙染色结合激光扫描共聚焦显微镜观察细胞核凝集及片断化。3)利用TUNEL方法检测细胞凋亡率。4.磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C(PC-PLC)活性检测：参考吴兴中等人的方法(Wu et al.,1997)。5.利用RNA干扰技术降低蛋白表达水平：利用化学合成的siRNA特异性阻断血管内皮细胞中ANXA7的表达。6.利用真核细胞过表达系统特异性上调蛋白表达：1)利用含annexin A7全长的表达载体pCMV6-XL5-ANXA7特异性上调血管内皮细胞中ANXA7的蛋白表达水平。2)免疫细胞化学染色法检测细胞内ANXA7蛋白水平。3)Western blot法检测细胞内ANXA7蛋白水平。7.活性氧(ROS)检测：利用荧光探针DCHF结合激光扫描共聚焦显微镜检测ROS水平。8.线粒体膜电位(MMP)检测：利用荧光探针JC-1结合激光扫描共聚焦显微镜检测MMP水平。9.细胞内蛋白表达水平及分布检测：1)利用免疫细胞化学染色法结合激光扫描共聚焦显微镜检测ANXA7、膜整联蛋白integrinβ4、caveolin-1的蛋白表达水平及分布。2)利用RT-PCR方法检测细胞内ANXA7、GAPDH的mRNA水平。3)利用Western blot方法检测LC3、beclinl、p62、ANXA7、p70S6K、p-p70S6K、4EBP1、p-4EBP1、GAPDH、β-actin的蛋白表达水平研究结果1.低浓度镉离子(Cd2+)诱导血管内皮细胞自噬并抑制因去除血清和生长因子引起的细胞凋亡1.1利用荧光探针检测镉离子进入血管内皮细胞的数量。结果显示细胞中荧光强度随镉离子的浓度升高而升高,具有明显的剂量依赖性。单纯探针本身仅显示微弱的荧光信号(图1-1)。1.2倒置显微镜观察结果显示1、5、10μM镉离子处理24h有效地减弱了由于去除血清和生长因子引起的内皮细胞从培养皿上脱离(图1-2)。1.3 TUNEL实验结果表明去除血清和生长因子明显引发内皮细胞凋亡,细胞核出现碎裂。镉离子处理后TUNEL阳性率明显降低,但10μM镉离子的作用有所减弱,TUNEL阳性率出现一定的回升(图1-3)。1.4在去除血清和生长因子条件下,吖啶橙染色显示低浓度的镉离子引起细胞内的酸性膜泡增多(图1-4),提示细胞自噬增强的可能性。1.5 Western blot结果表明自噬标记物MAP1 LC3-Ⅱ的蛋白含量增多(图1-5),表明自噬小体增多,自噬增强。2.低浓度镉离子(Cd2+)诱导血管内皮细胞自噬并抑制其凋亡的分子机制研究2.1分别用0、1、5、10μM镉离子处理用不含血清和生长因子培养液培养的血管内皮细胞4 h,接着用DCHF荧光探针检测细胞中的ROS水平。结果显示5、10μM镉离子处理的血管内皮细胞中探针荧光强度增强,细胞ROS水平升高(图1-6)。2.2在去除血清与生长因子的条件下,免疫细胞化学染色检测结果表明低浓度的镉离子降低了内皮细胞整联蛋白integrinβ4的含量,随着镉离子浓度的增高integrinβ4降低程度逐渐增加,呈现剂量依赖性(图1-7)。2.3免疫细胞化学染色方法检测细胞内小窝蛋白caveolin-1的表达水平,不同浓度的镉离子明显降低caveolin-1水平,其中5μM镉离子效果最显著(图1-8)。2.4在去除血清与生长因子的条件下,不同浓度的镉离子明显降低细胞内PC-PLC活性,其中5μM镉离子效果最显著(图1-9)。3.苯并噁嗪衍生物ABO诱导正常培养的血管内皮细胞发生自噬3.1应用不同浓度的苯并噁嗪衍生物ABO (10、25、50、100μM)处理血管内皮细胞24h,吖啶橙染色结果显示胞质内酸性膜泡增多。提前加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)处理抑制50μM ABO引起的酸性膜泡数量增多(图2-2A)。用流式细胞仪检测表明ABO将细胞内的吖啶橙荧光强度由对照组的3%左右提高到50%以上(图2-2B)。3.2小分子ABO处理血管内皮细胞24小时,将细胞固定后制成切片应用于透射电镜观察。ABO处理组中直径500nm左右的双层膜泡数量增多(图2-3,*所示),表明自噬小体增多。自噬抑制剂3-MA预先处理相对减少了双层膜结构的数量,进一步确证该双层膜结构为自噬小体。3.3利用免疫细胞化学染色方法检测血管内皮细胞中的自噬标记物微管相关蛋白轻链3 (MAPI LC3)。ABO (25、50、100μM处理血管内皮细胞24h后细胞质中出现明显点状簇集,表明LC3转移到自噬小体膜上,提示自噬小体形成。自噬抑制剂3-MA预先处理有效减少了LC3阳性膜泡的数量,抑制ABO诱导的自噬作用(图2-4)。3.4小分子ABO (25、50、100μM处理血管内皮细胞24 h后提取细胞全蛋白,Western blot方法检测LC3和自噬底物p62/SQSTM1的蛋白水平。随着ABO浓度升高,与磷脂酰乙醇胺(PE)结合的LC3-Ⅱ的含量逐渐升高,自噬底物p62的降解增加,细胞内含量减少。自噬抑制剂3-MA预先处理有效抑制LC3-Ⅱ的上调和p62的下调(图2-5)。3.5利用50μM ABO处理血管内皮细胞0、6、12、24 h后提取细胞全蛋白检测LC3的蛋白水平,利用自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin)作为阳性对照。在此时间区段中,随着时间的延长细胞内LC3-Ⅱ的含量逐渐升高,在24h达到相对最高值(图2-6)。3.6小分子ABO (25、50、100μM处理血管内皮细胞24h后提取细胞全蛋白,Western blot方法检测自噬另一标志性蛋白beclin1的水平。结果显示beclinl蛋白被小分子ABO上调,该作用可以被自噬抑制剂3-MA抑制(图2-7)。3.7利用巴弗洛霉素A1 (bafilomycin A1)抑制自噬溶酶体中蛋白酶的活性而阻断自噬流,进一步加入501μM小分子化合物ABO处理24h,结果显示ABO可以进一步增强巴弗洛霉素A1对LC3-Ⅱ的积累作用,说明ABO不是阻断自噬小体的降解,而是促进自噬小体的生成(图2-8)。4.膜联蛋白ANXA7在ABO诱导内皮细胞自噬中的作用4.1小分子ABO (25、50、100μM处理血管内皮细胞24h后提取细胞全蛋白,Western blot方法检测膜联蛋白ANXA7的水平。随着ABO浓度升高,ANXA7的蛋白水平被逐渐上调(图2-9A)。利用反转录PCR (RT-PCR)方法检测mRNA水平,结果显示ABO提高ANXA7的基因表达水平(图2-9B)。用50μM ABO处理血管内皮细胞0、6、12、24h后ANXA7蛋白水平升高,并呈现出时间依赖趋势(图2-9C)。利用免疫细胞化学染色结合激光共聚焦显微镜观察发现50μM小分子ABO处理血管内皮细胞24h后ANXA7在细胞内含量升高,且呈现出点状簇集分布的状态(图2-9D)。4.2利用不同浓度的ANXA7特异性干扰RNA (siANXA7,10.20.40 nM)处理血管内皮细胞24、48、72h,免疫细胞化学染色显示ANXA7的表达被有效抑制。在随后的实验中选择40nM处理24h作为实验条件(图2-10A)。利用不同浓度的siANXA7 (10.20.40 nM)处理血管内皮细胞24 h后提取全蛋白,Western blot检测ANXA7蛋白水平。随着siANXA7浓度的增高,ANXA7蛋白水平逐渐降低,其中40nM效果最明显,确证该实验条件有效干扰细胞内ANXA7蛋白表达(图2-10B)。4.3通过免疫细胞化学染色结合RNA干扰技术(RNAi)研究膜联蛋白ANXA7和自噬标记物LC3的定位情况。血管内皮细胞分别用无意义RNA (scramble RNA, Scr). ANXA7特异性干扰RNA (siANXA7)处理后,先后使用LC3和ANXA7抗体标记两种蛋白。激光共聚焦显微镜观察结果显示：在对照组和无意义RNA处理组,ABO处理血管内皮细胞24h后LC3出现点状簇集,同时胞质内ANXA7与LC3发生一定的共定位。而将ANXA7干扰掉之后,LC3点状簇集的数量明显减少。结果表明ANXA7在ABO诱导的血管内皮细胞自噬中可能发挥关键作用(图2-11)。4.4利用40nM ANXA7特异性干扰RNA (siANXA7)处理血管内皮细胞24 h,不同浓度小分子ABO (25、50、100μM继续处理24h。吖啶橙染色结合荧光显微镜观察结果显示：在对照组和无意义RNA处理组,ABO处理血管内皮细胞24h,细胞内酸性膜泡数量明显增多,且呈现一定的剂量依赖趋势。将ANXA7干扰掉之后,ABO处理细胞的酸性膜泡数量相对减少(图2-12)。4.5利用40 nM ANXA7特异性干扰RNA(siANXA7)处理24 h, ABO(50μM)继续处理血管内皮细胞24h后提取细胞全蛋白,Western blot方法检测ANXA7和LC3-Ⅱ蛋白含量。结果显示在无意义RNA组中ABO明显上调ANXA7和自噬蛋白LC3-Ⅱ的蛋白含量；在siANXA7组中ANXA7含量减少,同时LC3-Ⅱ的蛋白含量相对明显减少。表明ANXA7在ABO诱导的自噬中发挥关键作用(图2-13)。4.6利用蛋白质过表达系统研究ANXA7过表达对自噬的影响。血管内皮细胞分别用转染试剂Lipo2000,空质粒pCMV6-XL5,带有ANXA7全长序列的pCMV6-XL5-ANXA7质粒处理后提取细胞全蛋白,Western blot方法检测ANXA7和LC3-Ⅱ的蛋白含量。结果显示pCMV6-XL5-ANXA7处理组中ANXA7含量增高,LC3-Ⅱ含量明显升高。空质粒组中LC3-Ⅱ含量轻微升高,可能与空质粒刺激细胞产生一定的细胞反应有关(图2-14)。5.膜联蛋白ANXA7调控的自噬不参与经典的mTOR信号通路5.1小分子ABO(25、50、100μM)处理血管内皮细胞24h提取细胞全蛋白,Western blot方法检测经典的自噬信号通路哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)的下游分子p70S6K和4EBP1的磷酸化。雷帕霉素可以减低二者的磷酸化水平,从而诱导自噬发生。Western blot结果显示ABO处理后p70S6K和4EBP1的磷酸化状态没有改变(图2-15A)。用50μMABO处理血管内皮细胞0、6、12、24h后提取细胞全蛋白,Western blot结果显示在此时间区间p70S6K和4EBP1的磷酸化状态没有改变(图2-15B)。表明ABO和ANXA7诱导的自噬是不依赖于mTOR信号通路的。5.2分别用Scramble RNA和40nM ANXA7特异性干扰RNA(siANXA7)处理24h,加入雷帕霉素处理血管内皮细胞8h,提取细胞全蛋白检测自噬标记物LC3-Ⅱ和自噬底物p62的蛋白水平。雷帕霉素处理的对照组、无意义RNA组和siANXA7组中,雷帕霉素均可以明显提高LC3-Ⅱ,降低p62的水平,说明ANXA7不参与雷帕霉素诱导的自噬(图2-16)。6.苯并噁嗪衍生物ABO处理内皮细胞后ROS. MMP没有变化6.1小分子ABO(25、50、100μM)处理血管内皮细胞24 h,利用荧光探针DCHF检测活性氧(ROS)变化。结果显示ABO不影响细胞内ROS水平(图2-17A)。与ABO相反,小分子DBO (6,8-dichloro-2,3-dihydro-3-hydroxymethyl-1, 4-benzoxazine)提高细胞内ROS水平。ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预先处理可以有效抑制ROS水平的升高(图2-17B)。Western blot检测结果表明：NAC清除细胞内ROS后,DBO诱导的自噬被明显抑制,说明小分子DBO是通过ROS诱导细胞自噬的(图2-17C)。6.2小分子ABO(25、50、100μM)处理血管内皮细胞24h,利用荧光探针JC-1检测细胞内线粒体膜电位(MMP)变化,结果发现ABO不影响细胞内线粒体膜电位水平(图2-18)。结论：1.低浓度镉离子诱导血管内皮细胞发生自噬,抑制因去除血清和生长因子而诱发的凋亡作用。此过程中ROS水平升高, integrinβ4、caveolinl水平和PC-PLC活性降低。2.苯并噁嗪衍生物ABO激活血管内皮细胞发生自噬作用。3.苯并噁嗪衍生物ABO通过上调膜联蛋白A7(ANXA7)的水平激活自噬,ANXA7在ABO诱导的HUVEC自噬过程中是充分而且必要的条件。4.苯并噁嗪衍生物ABO激活的自噬作用是不依赖于哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)信号通路的。ANXA7不参与雷帕霉素诱导的自噬。5.苯并噁嗪衍生物ABO激活的自噬不依赖于活性氧(ROS)水平,而DBO激活的自噬依赖于ROS水平的升高。6.苯并噁嗪衍生物ABO不影响细胞内线粒体膜电位。